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比较代谢组学揭示喜马拉雅山两种濒危红豆杉的代谢差异

花匠小妙招
2025-03-25 22:01

发表期刊：BMC Plant Biology

影响因子：3.930（SCI二区）

研究背景

红豆杉属植物由于其天然产物紫杉醇是一种成功的抗癌药物而备受关注。密叶红豆杉T. fuana和云南红豆杉T. yunnanensis是分布在喜马拉雅山上两种濒危红豆杉品种。近年来，紫杉醇的市场需求超过供应，受到几个限制条件的限制，如红豆杉生长缓慢、紫杉醇含量低和合成路线复杂。目前紫杉醇的生物合成途径已经被揭示，产生了大量的紫杉醇前体、中间体和衍生物。

到目前为止，已鉴定出红豆杉属14种植物，但不同品种和品种间积累的紫杉醇含量差异很大。对这两种形态相似的红豆杉种类之间的紫杉醇类化合物以及其他次级代谢产物的种间差异性积累的代谢特征的研究将促进高产品种的繁育，并揭示物种和环境依赖的代谢变化的机制。本研究可为这两种濒危红豆杉种质资源的保存提供有价值的信息。

材料与方法

1.植物材料

分别采自西藏吉隆和西藏墨脱15株独立的10年生密叶红豆杉T. fuana和云南红豆杉T. yunnanensis的新鲜小枝(图1a)，吉隆平均海拔4000米，莫陀岛平均海拔1200米。

2.非靶标代谢组学

样品：两种红豆杉新鲜枝条样本25mg，设置15个生物重复(15株)。

检测平台：UPLC-Triple-TOF-5600+(AB SCIEX)Q，采用DIA数据采集模式。此外，每10个样品分析一次QC样品。

3.生物信息学分析

数据预处理：XCMS软件；

代谢物匹配：KEGG、HMDB数据库(10ppm)；

数据过滤：在不到50%的QC样品或80%的生物样品中检测到的特征被去除，并利用k近邻算法对缺失值的剩余峰值进行估计，进一步提高数据质量。此外，计算所有QC样品中代谢特征的相对标准偏差，然后去除那些>30%的相对标准偏差。

4.紫杉醇类化合物和黄酮类化合物靶标测定

样品：分别从两种红豆杉的6棵树采集新鲜枝条，样品在40℃下完全干燥，然后研磨成粉末；

检测平台：LC-30 AD UPLC-QTRAP 6500；多反应监测(MRM)用于正电离模式下测定紫杉醇类化合物，正、负离子模式下测定黄酮类化合物。

数据采集软件：MultiQuant软件(3.0版)

结果

两种濒危红豆杉的非靶标代谢分析

图1非靶向代谢物谱显示了云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana之间代谢物丰度的变化

注：a.密叶红豆杉植物枝条；b.用绿色小点和红色小点分别指示了密叶红豆杉T.fuana(吉隆)和云南红豆杉T.yunnanensis(墨脱)的采集点。(C)云南红豆杉植物枝条。d.两种红豆杉中所鉴定代谢物的热图(n=15)。

采用非靶向代谢组学方法(n=15)，从7,251个离子特征中鉴定出4,986种代谢物。图1d显示了两种红豆杉代谢物谱的概况。与树枝形态的相似性不同，结果表明，两种红豆杉的代谢体发生了显著的变化。

以鉴定到的代谢物被划分为至少一个一级或二级代谢类别。最大的20个代谢类别，如卟啉和叶绿素代谢(134个代谢物)，2-氧羧酸代谢(134个代谢物)，氨基酸生物合成(127个代谢物)，ABC转运蛋白(126种代谢物)、二萜类生物合成(103种代谢物)和其他次级代谢物(141种)。

代谢物谱显示了两种红豆杉代谢物丰度的变化

图2密叶红豆杉和云南红豆杉差异代谢物的鉴定

注：a.火山图展示两种红豆杉的差异代谢物。b.两种红豆杉在每一种代谢物类别中的代谢物数量。c.不同代谢类别的差异代谢物的数量。

为了提供代谢变化的深入概述，分析了用于量化的若干质量控制参数，包括变异系数（CV），主成分（PC）和归一化强度。过滤后，用4,986种优质代谢物筛选出差异代谢物(DAMS)(图2a)。统计分析确定了1,972个差异代谢物，云南红豆杉和密叶红豆杉分别为788和1,184个。

所有的DAMS都属于各种主要的代谢类别，包括生物碱、氨基酸、黄酮类化合物、激素、脂类、萜类化合物、苯丙类化合物、糖类等。在大多数这类植物中，两种红豆杉的主要积累的代谢物数量相似。例如，以萜类化合物为主的密叶红豆杉的数量与云南红豆杉的萜类化合物的数量相似(图2b)。在密叶红豆杉中测定了47个黄酮类化合物，而在云南红豆杉中仅测定到了14种黄酮类化合物。每种代谢物的归一化离子强度都是计算出来的，如图2c所示。

紫杉醇前体、中间体和竞争者的代谢物丰度变化

图3紫杉醇的前体、中间产物和竞争者的丰度变化

注：a.紫杉醇生物合成途径。b.这两种红豆杉中紫杉醇的前体、中间体、竞争者的相对数量的热图。来自MEP途径的前体被包含在一个红色的盒子里，中间体和衍生物被包含在一个紫色的盒子里，而紫杉醇的竞争者被包含在一个绿色的盒子里。

紫杉醇生物合成是一个复杂的代谢途径，涉及大量次生代谢物，包括紫杉醇的前体、中间体和竞争者(图3a)。结果表明，前体在密叶红豆杉和云南红豆杉中的积累量无显著差异，而紫杉醇主要积累在云南红豆杉中。有趣的是，大多数中间产物是在云南红豆杉中大量积累的，而类紫杉醇代谢物则大量积累在密叶红豆杉中(图3b)。

靶标定量分析证实了紫杉醇类化合物的变异

图4密叶红豆杉和云南红豆杉紫杉醇类物质含量的测定

注：a.采用UPLC-MS/MS法测定紫杉醇和6种中间体的含量。P值<0.001被认为具有统计学意义，并以“*”表示。b.正离子模式下云南红豆杉和密叶红豆杉紫杉醇的代表性色谱图。c.正离子模式下云南红豆杉和密叶红豆杉6种中间体的代表性色谱图。

为了准确评估紫杉醇及其衍生物的含量差异，用UPLCMS/MS方法对7种紫杉醇类化合物进行量化测定。非靶向代谢组学分析表明紫杉醇主要在云南红豆杉中积累，紫杉醇直接量化的真实标准证实了这种现象。云南红豆杉的紫杉醇的含量(0.084mg/g)是密叶红杉(0.027mg/g)的3.1倍。此外，与密叶红豆杉相比，其他6种中间体都在云南红豆杉中显著积累(图4A)。图4b和图c显示了密叶红豆杉和云南红豆杉的这些紫杉醇类化合物的代表性TIC色谱图。

黄酮类化合物丰度的变化

图5黄酮类和异黄酮类化合物的相对含量热图

迄今为止，已从各种红豆杉种中分离出大量黄酮类化合物。在我们的研究中，鉴定了参与类黄酮生物合成的35种代谢物和涉及异黄酮生物合成的17种代谢物。对于类黄酮生物合成，与云南红豆杉相比，除了叶黄素，黄腐酚和隐色花翠素外，大多数代谢物在密叶红豆杉中显著积累。对于异黄酮类生物合成，与云南红豆杉相比，除了美迪紫檀素，假靛黄素，和大豆苷元外，大多数代谢物主要在密叶红豆杉中积累(图5)。

定量分析证实了黄酮类化合物的变异

图6两种红豆杉中总黄酮和单个黄酮含量的测定

注：a.密叶红豆杉和云南红豆杉中总黄酮的含量。b.研究了两种红豆杉中8种黄酮类化合物的含量。P值<0.001被认为是有统计学意义，并以“*”表示。c.负离子模式下模式下单个黄酮类化合物的色谱图。d.正离子模式下模式下单个黄酮类化合物的色谱图。

对总黄酮和8种黄酮，包括芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、(+)-儿茶素、(−)-表儿茶素、异黄酮和银杏素的含量进行了测定。总黄酮含量在密叶红豆杉中显著高于云南红豆杉(图6a)。类似地，大多数黄酮类化合物(包括芹菜素、木犀草素、山奈酚、槲皮素、异黄酮和银杏素)主要积累在云南红豆杉中。只有(+)-儿茶素和(−)-表儿茶素两种黄酮类化合物主要在云南红豆杉中积累，而不是在密叶红豆杉中积累(图6b)。两种红豆杉样品中这些黄酮类化合物的代表性TIC色谱图如图6c和d所示。

总结

本试验采用代谢组学研究了在不同环境中生长的两种濒危物种：密叶红豆杉T.fuana和云南红豆杉T.yunnanensis新鲜枝条的代谢变异。总共鉴定出了属于不同代谢类别的4,986种代谢物。云南红豆杉T.Yunnanensis的紫杉醇含量显著高于密叶红豆杉T.fuana。所有已鉴定的紫杉醇生物合成中间体主要集中在云南红豆杉T.yunnanensis，而四种与紫杉醇生物合成有关的竞争者主要集中在密叶红豆杉T.fuana。此外，密叶红豆杉T.fuana中总黄酮和单个类黄酮的含量均显著高于云南红豆杉T.Yunnanensis。本研究为不同环境下两种濒危红豆杉种质资源的综合利用和保存提供了有价值的信息。

点击原文链接：https://doi.org/10.1186/s12870-018-1412-4查看论文全文。