红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因dxr的克隆与分析
近几年的研究表明,非甲羟戊酸途径可能是紫杉醇合成的主要途径,通过对各种不同来源的非甲羟戊酸途径关键酶5_磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(DXR)基因同源区域进行比较,设计出简并引物,利用RT_PCR技术从中国红豆杉( Taxus chinensis)悬浮细胞中扩增出535bp的基因片段。同源序
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红豆杉细胞非甲羟戊酸途径关键酶基因!"#的克隆与分析
郑清平余龙江"刘智李默怡向福杨秦
（华中科技大学生命科学与技术学院生物工程系，武汉#-""$#）
摘要近几年的研究表明，非甲羟戊酸途径可能是紫杉醇合成的主要途径，通过对各种不同来源的非甲羟戊酸
途径关键酶0.磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（EFG）基因同源区域进行比较，设计出简并引物，利用G5.H3G技术从中国红豆杉（3+4)&0"#$%$&#&）悬浮细胞中扩增出0-0IJ的基因片段。同源序列比对发现，推断的蛋白质序列与5*+6#7、、、;2$%0"(02&/#&@J(H3324"-8(9&#&/"+,#+$+（K1F7L1）:%$/"+49#9%*#/+（K1F:L"）;2$%0"(0(00)&%,($1+/)&（K4EM-"）（K0022-）、、的一致性分别达到10O、<(&/(0@J(H33$/!"（K4NH#1）;2$%0"(0(00)&,%(9(,#%$&#&（K1GM5/）1#O、4"O、特征区以及进化树分析，证实该基因确为84*基因，首次报道从裸子植物中$4O、$4O和$-O。结合蛋白质保守区、克隆到非甲羟戊酸途径关键酶的基因片段。关键词
中国红豆杉悬浮细胞，非甲羟戊酸途径，0.磷酸脱氧木酮糖还原异构酶，G5.H3G
K$4/
文献标识码
P
文章编号/""".-"2/（!""#）"#."0#4."2
中图分类号
萜类是一大类植物次生代谢产物，结构复杂、种类繁多。许多具有特殊生物活性萜类如赤霉素、脱落酸、胡萝卜素、类胡萝卜素、棉酚、青蒿素、紫杉醇等都被开发成为非常有价值的商品。
萜类是以异戊二烯为基本单元构建的，异戊烯焦磷酸（QHH）是合成萜类的重要前体。长期以来，该反应QHH一直被认为是经甲羟戊酸途径合成的，的限速步骤是-.羟基.-.甲基戊二酰辅酶P（RST.在还原酶（RSTG）的作用下生成甲羟戊酸3&P）
。因此，该途径被称为甲羟戊酸途径，一直被（S%P）
认为是萜类合成的经典途径（图/P）。但近年来，经/-3标记对植物和微生物萜类生物合成途径进行研究却发现许多与甲羟戊酸途径不一致的实验结
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果，并导致了新的类异戊二烯合成途径的发现。
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应，催化直链的五碳糖形成带有支链的异戊酸前
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体。目前已相继在薄荷（:%$/"+9#9%*/#+）、胡椒［0］［2］
、长春花（!+/"+*+$/")&*(&%)&）、拟南芥（=#9%*W(）
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（5*+6#8(9&#&/"+,#+$+）和;2$%0"(0(00)&,%(9(,#%$&#&
中找到了该基因同源区，并作了描述。
但在萜类物质合成旺盛的针叶类植物中却未见对该基因及非甲羟戊酸途径的研究报道，为了证实红豆杉中是否也存在非甲羟戊酸途径，以便更深入研究紫杉醇生物合成途径及其分子调控机理，本文根据已发现的该途径中的关键酶EFG的基因进行同源序列的比对，然后进行简并引物的设计，并以红豆杉为材料，对该基因片段进行了克隆和序列分析。
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材料与方法
材料
新途径以/.脱氧.E.木酮糖.0.磷酸作为反应起始，因此该途径又称为磷酸木酮糖途径或非甲羟戊酸途
［!］
径，该途径的主要反应步骤如图/U所示。
本实验以中国红豆杉悬浮细胞（3+4)&0"#$%$&#&
为材料，来源于胚芽经愈伤组织诱@+@J6D@<&DC6’’@）
导和驯化培养获得的悬浮细胞系，已经经过0年的继代培养，由本实验室保存。!"#
细胞培养与继代
基本培养基为改良SL培养基附加)PP
目前非甲羟戊酸途径中的一些酶已在部分植物和微生物中得到克隆。0.磷酸脱氧木酮糖还原异构
酶（/.B6&9,.E.9,’+’&@6.0.J?&@J?8A6V6B+CA&<@&;6V8@6@，是该途径中的关键酶，参与该途径的第二步反EFG）
收稿日期：!""-.//."$，修回日期：!""#."!./0。
基金项目：国家九五重点攻关（)&(12.3"!."-."/）、国家42-（)&(/"!.3"2."/."!）及教育部骨干教师基金。"通讯作者。
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