首页 > 分享 > 利用斑马鱼模型评价丹参花成分美白及抗氧化功效

利用斑马鱼模型评价丹参花成分美白及抗氧化功效

花匠小妙招
2025-04-21 23:51

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参ＳａｌｖｉａｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａＢｇｅ．的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈等功效。丹参临床应用广泛，市场需求量巨大，目前全国的栽培面积已达１．３万公顷，由于在栽培过程中为提高其药用部分产量，常进行打顶操作，大量地上茎叶和花部资源被废弃，造成严重的环境压力和资源浪费。研究发现丹参茎叶等非药用部位具有与根中相似的酚酸、黄酮、挥发油、三萜类和有益无机元素等化学成分，表现出抗氧化、抗炎、改善皮肤微循环和抗菌等药理活性，可用于新药源及保健品等方面的开发。因此，针对丹参非药用部位进行深入研究和开发利用有助于提升丹参资源利用效率和效益。

除临床应用外，目前丹参提取物在复方中药化妆品美白祛斑领域中也引起了广泛的关注。人体内黑色素的形成过程较为复杂，不仅与酪氨酸酶以及多种黑色素合成代谢的中间体有关，还与自由基等因素密切相关。研究表明，体内的氧自由基既利于脂褐素的生成，又可提高酪氨酸酶的催化活性以及多巴醌等中间体的氧化反应，进一步在细胞中堆积造成黑色素沉淀。

由于人们对天然温和的美白产品的青睐，从中草药中提取天然抗氧化剂已成为目前美白产品研发的主流。丹参酚酮类成分作为从丹参药用部位中分离出来的天然活性抗氧化剂，关于其抗氧化和美白祛斑活性研究较多，但对其非传统药用部分的开发利用则鲜有文献报道。

实验方法

丹参花酚酮类成分供试品溶液的制备 取一年生盛花期紫色丹参花样品，４０℃烘干，粉碎为６０目备用。按照料液比１∶ １２加入丹参花样品粉末和６０％乙醇，８０℃ 下回流提取２次，每次２ｈ，合并滤液，减压浓缩即得丹参花粗提液。选用ＨＰＤ－１００型号大孔吸附树脂对丹参花粗提液进行分离纯化，冷冻干燥得到丹参花酚酮类纯化粉末。采用Ｗａｔｅｒｓｅ２６９５－２４８９型高效液相仪，选用ＸＳｅｌｅｃｔＲＨＳＳＣ１８ＳＢ（２５０ｍｍ × ４．６ｍｍ，５ μｍ）色谱柱，以乙腈（Ａ）－０．３％甲酸水溶液（Ｂ）为流动相，梯度洗脱程序为０～４ｍｉｎ，８％～１０％Ａ；１０～１７ｍｉｎ，１７％～１８％Ａ；２７～３０ｍｉｎ，２０％～２２％Ａ；３５～５０ｍｉｎ，２３％～２４％Ａ；５５～６５ｍｉｎ，３０％～３４％Ａ；７５～８０ｍｉｎ，４０％～４０％Ａ；８５～９５ｍｉｎ，８％～８％Ａ；流速为０．４ｍＬ／ｍｉｎ；柱温为３５℃ ；进样量为１０ μＬ。于２７５ｎｍ下测定丹参花酚酮类纯化粉末中酚酮类成分总量为５２．７０％，其中总酚酸、总黄酮含量分别为５８．３０、１６９．７０ｍｇ／ｇ，含量较高的迷迭香酸和丹酚酸Ｂ的含量分别为３５．９１、１３．３２ｍｇ／ｇ。

丹参花酚酮类成分的斑马鱼耐受实验 挑选受精后第２４ｈ（ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ－ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｈｐｆ）的斑马鱼胚胎，按１０个胚胎／孔分配至２４孔板中，每孔加入待测化合物溶液２ｍＬ。丹参花酚酮类成分给药组设置１０个浓度梯度（１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００、８００ μｇ／ｍＬ），另设空白对照组（斑马鱼胚胎培养液）和溶剂对照组（０．１％ＤＭＳＯ－斑马鱼胚胎培养液）。每组设置４个平行，于２８．０℃恒温培养箱中继续避光培养７２ｈ。在实验终点，于体式显微镜下观察斑马鱼给药后的形态变化，计算胚胎孵化率、死亡率以及畸形率。

胚胎孵化率＝孵化的胚胎数量／总胚胎数量 × １００％

胚胎死亡率＝死亡的胚胎数量／总胚胎数量 × １００％

胚胎畸形率＝畸形的胚胎数量／总胚胎数量 × １００％

丹参花酚酮类成分对斑马鱼抗氧化活性的测定 选取发育正常的２４ｈｐｆ的斑马鱼胚胎于２４孔板中，每孔１０条，采用ＡＡＰＨ诱导构建斑马鱼胚胎氧化应激模型［１３］。根据最大安全浓度筛选结果，设置５个给药亚组（３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ μｇ／ｍＬ），分别加入对应体积的药物贮备液和１ｍＬＡＡＰＨ贮备液，并用斑马鱼胚胎培养液补至２ｍＬ；同时设置空白对照组（２ｍＬ斑马鱼胚胎培养液）、模型组（２ｍＬＡＡＰＨ贮备液）、溶剂对照组（２ｍＬ０．１％ＤＭＳＯ－斑马鱼胚胎培养液）和阳性对照组（０．００２ｍＬ乙酰半胱氨酸贮备液和１．９９８ｍＬＡＡＰＨ母液）。每组设置４个平行，各实验组置于２８℃培养箱恒温避光培养４８ｈ。参照活性氧检测试剂盒说明书通过ＣＭ－Ｈ２ＤＣＦＤＡ荧光探针对斑马鱼体内活性氧进行染色。

在实验终点，各实验组从表型和行为正常的斑马鱼中随机选取３０条，０．２５ｍｇ／ｍＬ三卡因麻醉，用１％甲基纤维素固定于载玻片上，于荧光显微镜下采集图片。使用Ｉｍａｇｅｊ６４图像分析软件统计各组斑马鱼胚胎的ＲＯＳ荧光强度，荧光积分密度值越小说明其对ＡＡＰＨ造成的斑马鱼氧化应激损伤的改善作用越好。

丹参花酚酮类成分在ＡＡＰＨ诱导斑马鱼氧化应激模型的抗氧化活性评价 如图 1 所示，与空白对照组相比，模型对照组斑马鱼荧光积分密度显著提高，表明斑马鱼氧化应激模型造模成功（Ｐ＜０．０５）。溶剂对照组与模型对照组斑马鱼荧光积分密度不具有显著性差异（Ｐ＞０．０５），表明助溶剂对荧光测定不造成影响。阳性对照组斑马鱼荧光积分密度显著低于模型对照组（Ｐ＜０．０１），表明乙酰半胱氨酸（２００ｍｍｏｌ／Ｌ）对氧化应激损伤具有较好的改善作用，说明阳性对照物及其浓度选取合适。给药组中，不同药物浓度下斑马鱼荧光积分密度值均显著低于模型对照组（Ｐ＜０．０１），表明丹参花酚酮类成分能够有效改善斑马鱼体内的氧化应激作用；并且，当浓度达到５０ μｇ／ｍＬ时，荧光积分密度值最小，说明此浓度下丹参花酚酮类成分能够有效逆转ＡＡＰＨ造成的斑马鱼氧化应激损伤。以上结果与体式显微镜下观察到的结果一致。

结论：

与传统模式生物相比，斑马鱼及其胚胎个体体积小，适用于微孔培养板培养，可进行高通量筛选，且具有繁殖周期短、实验用药少、费用低等优势。并且，斑马鱼身体表面的大量黑色素可以直接用于评价药物对黑色素的抑制效应，其胚胎具有高度的光学通透性，便于观察，可简化美白活性成分和产品功效评价的过程，是一种高效实用的新兴生物模型。ＡＡＰＨ作为一种自由基产生剂，通过引发氧自由基产生造成细胞氧化应激损伤，被广泛用于建立模式生物的氧化应激模型，通过荧光强弱评价抗氧化剂的功效。本研究成功建立了一种基于斑马鱼模型的黑色素合成抑制和抗氧化活性研究的方法，验证了斑马鱼可以作为评价中药美白活性成分功效的模式生物。

参考文献：

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典，一部［Ｓ］．北京：中国医药科技出版社，２０２０．

[2]段金廒．中药废弃物的资源化利用［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２０１３．

[3]沙秀秀，宿树兰，沈飞，等．不同生长期丹参茎叶及花序中丹酚酸类化学成分的分布与积累动态分析评价［Ｊ］．中草药，２０１５，４６（２２）：３４１４．

[4]曾慧婷，宿树兰，沙秀秀，等．丹参茎叶提取物抗氧化活性物质基础与量效关系研究［Ｊ］．中草药，２０１７，４８（２２）：４６８８．

[5]基于斑马鱼模型的丹参花中酚酮类成分美白及抗氧化效果探究陈　酉１，２，王素娟１，２，张飞宇３，４，杨林林１，２，乔璐１，２，董诚明１，２，董宁