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一种莎叶兰离体培养快繁方法.pdf

花匠小妙招
2025-04-25 05:23

一种莎叶兰离体培养快繁方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养领域，尤其涉及一种莎叶兰离体培养快繁方法。

背景技术

莎叶兰(Cymbidium cyperifolium)是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)的一
种地生或半附生兰，花形及花色与寒兰相似，具柠檬香气，有较高的园艺观赏价值，但是由
于无度采挖而造成数量锐减，多种兰属植物已处于濒危状态。莎叶兰(Cymbidium
cyperifolium)是兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)的一种地生或半附生兰，分布于尼
泊尔、柬埔寨、不丹、印度、缅甸、老挝、越南、泰国和菲律宾等国，在我国主要分布广东、海
南、广西南部、贵州西南部、云南东南部等地，主要生长于海拔900～1600米的林下排水良
好、多石之地或岩石缝中。

莎叶兰的花期在10月至次年的2月，花型及花色与同属的寒兰(C.kanran)极为相
似，花香具有清淡的柠檬香气，颇受人们喜爱。目前已知的全球最大的莎叶兰野生居群位于
广西雅长兰科植物国家级自然保护区内，绝大部分莎叶兰处于野生状态，但由于利益驱使，
常被无度采挖和交易，加之生境地的恶化，数量锐减，处于濒危状态，因此对其人工繁殖并
进行野外回归刻不容缓！

目前，对莎叶兰的研究主要集中在生长环境、分布状况及生活类型的调查等方面，
国内外尚未见有关莎叶兰离体培养方面的研究报道。

发明内容

为了解决上述技术的不足，本发明提供一种旨在通过诱导、增殖、分化、壮苗、炼苗
移栽等过程成功获得了健壮的莎叶兰组培苗，建立莎叶兰离体培养技术体系的莎叶兰离体
培养快繁方法。

为了实现上述技术目的，本发明的提供的技术方案是这样的：一种莎叶兰离体培
养快繁方法，依次包括根状茎的诱导步骤、根状茎的增殖步骤及分化培养步骤，所述的根状
茎的诱导步骤为将外植体的芽点置于诱导培养基中进行培养；

其中，所述的诱导培养基包括：N6培养基、1.0～6.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.5～
3.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、25～30g/L蔗糖、4.5～6.0g/L琼脂、80～100ml/L椰子汁，所述
的诱导培养基的pH为5.4～5.8。

需要说明的是，所述的根状茎的增殖步骤为将诱导获得的根状茎接种到增殖培养
基中进行培养；

其中，所述的增殖培养基包括：MS、0.5～3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.5～1.0mg/L
萘乙酸、15～25g/L蔗糖、3.5～4.5g/L琼脂、0.1～0.2g/L活性炭，所述的增值培养基的pH为
5.4～5.8。

需要说明的是，所述的分化培养步骤为将增殖获得的根状茎接种到分化培养基中
进行培养；

其中，所述的分化培养基包括：MS、0.5～1.5mg/L萘乙酸、0.1～0.5mg/L 2,4-二氯
苯氧乙酸、15～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L琼脂、0.05～0.1g/L活性炭，所述的分化培养基的
pH为5.4～5.8。

需要说明的是，在分化培养步骤之后还包括壮苗培养步骤，即将分化培养所得的
试管小苗转接至壮苗培养基中进行培养；

其中，所述的壮苗培养基包括：1/2MS、0.1～0.5mg/L萘乙酸、15～20g/L蔗糖、3.5
～4.0g/L琼脂，所述的壮苗培养基的pH为5.4～5.8。

需要说明的是，在壮苗培养步骤之后还包括炼苗和移栽步骤，即将试管苗根部放
于自然光下至根系发白，将其放入混合基质中栽培成苗；

其中，所述的混合基质为：体积比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩。

需要说明的是，所述的根状茎的诱导步骤中的培养温度为25～28℃。

需要说明的是，所述的根状茎的增殖步骤、分化培养步骤及壮苗培养步骤的培养
条件均为：光照强度为1500～2000lx，光照时间为12～15小时/天。

需要说明的是，所述的根状茎的诱导步骤中的培养时间为120～150天，所述的根
状茎的增殖步骤中的培养时间为30～45天，所述的分化培养步骤中的培养时间为45～60
天，所述的壮苗培养步骤中的培养时间为20～30天，所述的炼苗和移栽步骤中的炼苗时间
为1～3天。

需要说明的是，所述的根状茎的诱导步骤为：

步骤S1：将外植体用水冲洗过夜，剥去外层的叶鞘至仅剩下两层叶鞘；

步骤S2：进入超净工作台中操作，将其置于0.1％的升汞溶液中进行消毒，无菌水
冲洗，剥去一层叶鞘；

步骤S3：再次将其置于0.1％的升汞溶液中进行消毒，用无菌水漂洗，剥去最后一
层叶鞘；

步骤S4：用无菌水漂洗，用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，取其芽点接种到诱导
培养基中进行暗培养。

需要说明的是，所述的根状茎的诱导步骤之前，还包括外植体选择步骤，即当春季
新芽萌动时，在野外选择无明显病害的成年莎叶兰植株，用解剖刀小心切取叶鞘未打开的
新生营养芽，用湿润的白纱布包裹保水处理后迅速带回实验室并及时实验。

本发明的有益效果为：

1.本发明通过外植体选择、根状茎的诱导、根状茎的增殖、分化培养、壮苗培养、炼
苗和移栽六个步骤成功获得了健壮的莎叶兰组培苗，建立莎叶兰离体培养技术体系；

2.通过本发明培养获得的莎叶兰组培苗的存活率可达90％以上。

具体实施例

下面结合具体实施例对权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限
制，任何人在本发明权利要求范围内所做的有限次的修改，仍在本发明权利要求范围内。

实施例1

1、外植体选择：2014春季，在野外选择无明显病害的成年莎叶兰植株，用解剖刀小
心切取叶鞘未打开的新生营养芽，用湿润的白纱布包裹保水处理后迅速带回实验室并及时
实验；

2、根状茎的诱导：将外植体用水冲洗过夜，剥去外面的叶鞘至仅剩下两层叶鞘；置
于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗2次后剥去一层叶鞘；再置
于0.1％的升汞溶液中消毒1分钟，用无菌水漂洗3次后剥去最后一层叶鞘；用无菌水漂洗5
次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，用无菌解剖刀将外植体纵向切成0.3～0.5cm左右
的芽点，接种到诱导培养基中暗培养120天，培养温度为25℃，即可诱导形成长度约为4～
7cm的根状茎，诱导率为63.8％，污染率低于15％；

所述的诱导培养基为：N6培养基+6.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+3.0mg/L 2,4-二氯苯
氧乙酸+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂+80ml/L椰子汁，pH为5.4；

3、根状茎的增殖：将诱导获得的根状茎用无菌解剖刀切成长度约为0.5～1.0cm的
茎段并接种到增殖培养基中培养30天，培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12
小时/天，即可获得长度为5～8cm、健壮的根状茎，增殖系数达到8.3；

所述的增殖培养基为：MS+3.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+1.0mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+
3.5g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.4；

4、分化培养：将增殖获得的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培
养基中培养45天，培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天，即能分化出
试管小苗，分化率为78.6％；

所述的分化培养基为：MS+1.5mg/L萘乙酸+0.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+15g/L蔗
糖

+3.5g/L琼脂+0.05g/L活性炭，pH为5.4；

5、壮苗培养：切除与分化所得的试管小苗根部粘连的根状茎并将小苗转接至壮苗
培养基中培养20天，培养温度为25℃，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天，即可获得
高约4～6cm的莎叶兰组培苗；

所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.5mg/L萘乙酸+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。

6、炼苗和移栽：将壮苗培养所得健壮的、高约6～9cm的试管瓶苗在温室的自然光
下打开组培瓶盖子炼苗1天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积
比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得莎叶兰种苗，移栽30后成活率达
90％以上。

实施例2

1、外植体选择：2015年春季，当新芽萌动时在野外选择无明显病害的成年莎叶兰
植株，用解剖刀小心切取叶鞘未打开的新生营养芽，用湿润的白纱布包裹保水处理后迅速
带回实验室并及时实验；

2、根状茎的诱导：将外植体用水冲洗过夜，剥去外面的叶鞘至仅剩下两层叶鞘；置
于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒18分钟，无菌水冲洗2次后剥去一层叶鞘；再置
于0.1％的升汞溶液中消毒3分钟，用无菌水漂洗4次后剥去最后一层叶鞘；用无菌水漂洗6
次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，用无菌解剖刀将外植体纵向切成0.3～0.5cm左右
的芽点，接种到诱导培养基中暗培养130天，培养温度为26℃，即可诱导形成长度约为4～
7cm的根状茎，诱导率为72.8％，污染率低于12％；

所述的诱导培养基为：N6培养基+4.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+1.8mg/L 2,4-二氯苯
氧乙酸+27g/L蔗糖+5.5g/L琼脂+85ml/L椰子汁，pH为5.6；

3、根状茎的增殖：将诱导获得的根状茎用无菌解剖刀切成长度约为0.5～1.0cm的
茎段并接种到增殖培养基中培养37天，培养温度为26℃，光照强度为1700lx，光照时间为13
小时/天，即可获得长度为5～8cm、健壮的根状茎，增殖系数达到7.6；

所述的增殖培养基为：MS+1.9mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.8mg/L萘乙酸+21g/L蔗糖+
4.0g/L琼脂+0.15g/L活性炭，pH为5.6；

4、分化培养：将增殖获得的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培
养基中培养55天，培养温度为26℃，光照强度为1700lx，光照时间为13小时/天，即能分化出
试管小苗，分化率达到80.9％；

所述的分化培养基为：MS+0.9mg/L萘乙酸+0.3mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+23g/L蔗
糖+4.0g/L琼脂+0.07g/L活性炭，pH为5.6；

5、壮苗培养：切除与分化培养所得的试管小苗根部粘连的根状茎并将小苗转接至
壮苗培养基中培养26天，培养温度为26℃，光照强度为1700lx，光照时间为13小时/天，即可
获得高约4～6cm的莎叶兰组培苗；

所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.4mg/L萘乙酸+18g/L蔗糖+3.7g/L琼脂，pH为5.6；

6、炼苗和移栽：将壮苗培养所得健壮的、高约6～9cm的试管瓶苗在温室的自然光
下打开组培瓶盖子炼苗2天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积
比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得莎叶兰种苗，移栽30后成活率达
到93％以上。

实施例3

1、外植体选择：2016年春季当莎叶兰新芽萌动时，在野外选择无明显病害的成年
莎叶兰植株，用解剖刀小心切取叶鞘未打开的新生营养芽，用湿润的白纱布包裹保水处理
后迅速带回实验室并及时实验；

2、根状茎的诱导：将外植体用水冲洗过夜，剥去外面的叶鞘至仅剩下两层叶鞘；置
于超净工作台中于0.1％的升汞溶液中消毒20分钟，无菌水冲洗3次后剥去一层叶鞘；再置
于0.1％的升汞溶液中消毒5分钟，用无菌水漂洗5次后剥去最后一层叶鞘；用无菌水漂洗7
次后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分，用无菌解剖刀将外植体纵向切成0.3～0.5cm左右
的芽点，接种到诱导培养基中暗培养150天，培养温度为28℃，即可诱导形成长度约为4～
7cm的根状茎，诱导率为57.4％，污染率在5％以下；

所述的诱导培养基为：N6培养基+1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/L 2,4-二氯苯
氧乙酸+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂+100ml/L椰子汁，pH为5.8；

3、根状茎的增殖：将诱导获得的根状茎用无菌解剖刀切成长度约为0.5～1.0cm的
茎段并接种到增殖培养基中培养45天，培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为15
小时/天，即可获得长度为5～8cm、健壮的根状茎，增殖系数为6.4。

所述的增殖培养基为：MS+0.5mg/L 6-苄氨基腺嘌呤+0.5mg/L萘乙酸+25g/L蔗糖+
4.5g/L琼脂+0.2g/L活性炭，pH为5.8；

4、分化培养：将增殖获得的根状茎切成长度为1.5～2.0cm的茎段并接种到分化培
养基中培养60天，培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为15小时/天，即能分化出
试管小苗，分化率为74.1％；

所述的分化培养基为：MS+0.5mg/L萘乙酸+0.1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗
糖+6.0g/L琼脂+0.1g/L活性炭，pH为5.8；

5、壮苗培养：切除与分化培养所得的试管小苗根部粘连的根状茎并将小苗转接至
壮苗培养基中培养30天，培养温度为28℃，光照强度为2000lx，光照时间为15小时/天，即可
获得高约4～6cm的莎叶兰组培苗；

所述的壮苗培养基为：1/2MS+0.1mg/L萘乙酸+20g/L蔗糖+4.0g/L琼脂，pH为5.8；

6、炼苗和移栽：将壮苗培养所得健壮的、高约6～9cm的试管瓶苗在温室的自然光
下打开组培瓶盖子炼苗3天，洗净根部的培养基后在温室的自然光放置至根系发白，在体积
比为2:2:1的树皮、兰石、泥岩的混合基质中栽培成苗即得莎叶兰种苗，移栽30天后成活率
90％以上。

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任
何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。