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一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法.pdf

花匠小妙招
2025-05-01 20:24

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1、(10)授权公告号 CN 102612965 B (45)授权公告日 2013.04.10 CN 102612965 B *CN102612965B* (21)申请号 201210097484.7 (22)申请日 2012.04.05 A01G 1/00(2006.01) A01G 31/00(2006.01) A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人中国科学院西双版纳热带植物园地址 666303 云南省西双版纳傣族自治州勐腊县勐仑镇 (72)发明人盛春玲高江云林华范旭丽 (74)专利代理机构昆明协立知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 53108 代理人谢嘉。

2、 CN 1623373 A,2005.06.08, CN 1912101 A,2007.02.14, CN 101565677 A,2009.10.28, 柯海丽等 . 兰科植物种子原地共生萌发技术及其应用前景 .林业科学 .2007, 第 125-129 页 . (54) 发明名称一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法 (57) 摘要本发明公开了一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法。利用硬叶兰原生地植株周围的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，和硬叶兰的种子在实验室进行迁地共生萌发，诱导种子萌发产生原球茎；将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培。

3、养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落；将获得的真菌和硬叶兰的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真菌对硬叶兰的种子萌发的有效性，筛选出硬叶兰种子萌发的有效共生真菌，并进行真菌的分子鉴定和保存。本发明操作简单，获得的真菌种类单一，不需要大量繁琐的筛选过程，为利用硬叶兰种子和真菌共生萌发来培育种苗开辟了一条新的途径。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员张彦伍权利要求书 1 页说明书 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 4 。

4、页 1/1 页 2 1. 一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下的步骤：（1）在硬叶兰花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后用无菌的密闭玻璃容器置于 -20条件下保存，待用；（2）收集硬叶兰成年植株根部 20 cm 范围内的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质制成培养基质，分装在培养皿中，在基质上放置一层无菌尼龙网布，用无菌蒸馏水使培养基质的水分达到饱和，每个培养皿中再放置 10 块无菌尼龙网片，在每个尼龙网片上均匀播撒硬叶兰种子，将播种好的培养皿放入人工气候箱内进行培养；（3）在培养过程中，每周进行观测，。

5、记录种子的萌发情况，当观测到有种子萌发时，记录每一阶段种子或原球茎的数量，培养 30 40 天后获得原球茎；（4）将获得的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基 PDA 上进行培养；（5）原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的 PDA 培养基上，转移 3 5 次后，得到纯菌落；（6）将消毒后的硬叶兰种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在灭菌后的燕麦琼脂培养基表面放置两张无菌滤纸，分别吸取 150 微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在燕麦琼脂培养基中心。

6、接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理 10 个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养；（7）每周观察 1 次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，并对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出硬叶兰种子萌发的有效共生真菌。 2. 根据权利要求 1 所述的获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于：所述的无菌尼龙网布孔径为 45 m。 3. 根据权利要求 1 所述的获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于：步骤（2）所述培养。

7、的具体条件为 : 光照强度为 2000Lx-3000Lx, 温度 25 2，光周期 12h/12h L/D。 4. 根据权利要求 1 所述的获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于：步骤（4）所述的次氯酸钠溶液有效氯离子浓度为 1%，消毒 3 5 分钟，无菌水冲洗 3 4 次。 5. 根据权利要求 1 所述的获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，其特征在于：步骤（6）所述培养的具体条件为 : 光照强度为 2000Lx-3000Lx, 温度 25 2，光周期 12h/12h L/D。权利要求书 CN 102612965 B 2 1/4 页 3 一种。

8、获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法技术领域 0001 本发明涉及获得兰科植物种子萌发有效共生真菌的方法，具体来说涉及一种利用硬叶兰 (Cymbidium bicolor) 原生地收集的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，在实验室培养诱导种子萌发，获得原球茎，再从原球茎中分离、培养和筛选出种子萌发有效共生真菌的方法。背景技术 0002 兰科植物的种子非常细小，仅有发育不完全的胚，在自然条件下种子萌发需要依靠特定的共生真菌来获取营养物质。目前兰科植物种子的萌发，多采用人工培养基在无菌条件下进行非共生萌发，萌发率虽高，但在进行濒危种类野外回归时，幼苗。

9、移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。通过种子和其有效萌发真菌在自然条件下的共生萌发能很好的解决这一问题。有效真菌的获得目前多采用从兰科植物野生植株的根中分离，但由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。因此，获得种子萌发的有效共生真菌是开展珍稀濒危兰科植物回归的关键环节。发明内容 0003 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，为实。

10、现硬叶兰的野外回归创造条件。 0004 本发明的目的通过以下技术方案予以实现。 0005 除非另有说明，本发明所采用的百分数均为重量百分数。 0006 本发明的技术方案主要是基于以下认识： 0007 我们收集硬叶兰原生地植株周围的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，和硬叶兰的种子在实验室进行迁地共生萌发，诱导种子萌发产生原球茎，将获得的原球茎表面灭菌后在无菌条件下用人工培养基培养，诱导原球茎中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落，并进行真菌的分子鉴定和保存。将获得的真菌和硬叶兰的种子进行共生萌发培养，设置对照实验，以检验所获得的真。

11、菌对硬叶兰的种子萌发的有效性，结果表明所获得的真菌是硬叶兰种子萌发的有效共生真菌，从而实现了本发明的目的。 0008 一种获得硬叶兰种子萌发有效共生真菌的方法，包括以下的步骤： 0009 (1) 在硬叶兰花期进行人工异交授粉，果实成熟但果荚尚未裂开时收获果实，将种子干燥后用无菌的密闭玻璃容器置于 -20条件下保存，待用； 0010 (2) 收集硬叶兰成年植株根部 20cm 范围内的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质制成培养基质，分装在培养皿中，在基质上放置一层无菌尼龙网布，用无菌蒸馏水使培养基质的水分达到饱和，每个培养皿中再放置 10 块无菌尼龙网片，在每个尼。

12、龙网片上均匀播撒硬叶说明书 CN 102612965 B 3 2/4 页 4 兰种子，将播种好的培养皿放入人工气候箱内进行培养； 0011 (3) 在培养过程中，每周进行观测，记录种子的萌发情况，当观测到有种子萌发时，记录每一阶段种子或原球茎的数量，培养 30 40 天后获得原球茎； 0012 (4) 将获得的原球茎依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗后切成两半，切口面贴于马铃薯葡萄糖培养基 PDA 上进行培养； 0013 (5) 原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的 PDA 培养基上，转移 3 5 次后，得。

13、到纯菌落； 0014 (6) 将消毒后的硬叶兰种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液，在灭菌后的燕麦琼脂培养基表面放置两张无菌滤纸，分别吸取 150 微升的种子悬浮液均匀地散布在两张滤纸条上；在培养基中心接种含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理 10 个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养； 0015 (7) 每周观察 1 次不同处理的种子，记录种子萌发数量及萌发时间，并对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，记录每一阶段内种子或原球茎的数量，通过和不接菌处理组的对比，筛选出硬叶兰种子萌发的有效共生真菌。 0016 所。

14、述的无菌尼龙网布孔径为 45m。 0017 上述步骤中，步骤 (1) 所述的种子干燥并保存前，用 75的酒精对果荚表面进行消毒 3 5 分钟后，用无菌水清洗 3 4 次后用无菌刀片切开果实取出种子。 0018 步骤 (2) 所述的收集的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等，放在阴凉处自然风干后，用家用搅碎机加入无菌蒸馏水充分搅碎，混合均匀后作为培养基；所述的培养条件为：光照强度为 2000Lx-3000Lx，温度 25 2，光周期 12h/12h L/D。 0019 步骤 (3) 所述的在培养过程中，确保每个培养皿中的培养基质保持湿润，但处于水分不饱和的状态。。

15、0020 步骤 (4) 所述的次氯酸钠溶液有效氯离子浓度为 1，消毒 3 5 分钟，无菌水冲洗 3 4 次；本步骤同时设置对照处理，用同一来源的原球茎表面灭菌后不切开直接置于 PDA 培养基中，若对照组培养基内未长出真菌，说明从实验组原球茎切口周围长出的真菌为原球茎的内生共生真菌。培养皿用封口膜封好后放入人工气候箱内， 252黑暗培养。 0021 步骤(6)所述的150微升的悬浮液约含150粒硬叶兰种子，所述的培养条件为：光照强度为 2000Lx-3000Lx，温度 25 2，光周期 12h/12h L/D。 0022 步骤(7)所述的种子萌发和原球茎发育情况参照。

16、Stewart & Zettler(2002)的方法对种子萌发和原球茎发育情况进行分级，分为 5 个阶段：阶段 0 描述为种胚透明，种皮完好，种子未萌发，阶段 1 描述为种胚吸水膨胀；阶段 2 描述为种胚继续膨大，突破种皮，视为萌发；阶段 3 描述为出现原生分生组织；阶段 4 描述为长出第一片叶片；阶段 5 描述为第一片叶片继续生长，变长。 0023 Stewart SL， Zettler LW(2002)Symbiotic germination of three semi-aquatic rein orchids(Habenaria repens，。

17、 H.quinqueseta， H.macroceratitis)from Florida( 佛罗里达三种半水生玉凤花属植物 (Habenaria repens， H.quinqueseta， H.macroceratitis) 的种子共生萌发 ).Aquatic Botany( 水生植物学 )， 72， 25-35。 0024 对所获得的硬叶兰种子萌发有效共生真菌进行分子鉴定和比对，其为瘤菌根菌属 (Epulorhiza) 真菌，且与美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI， http:/www.ncbi. 说明书 CN 102612965 B 4 3/4 页 5 nlm.ni。

18、h.gov/) 中登录号为 AJ313440.1 的真菌 Epulorhiza sp. 最为相似，最大相似度达到 98，对其编号为 FCb4，采用试管斜面法保存于中国科学院西双版纳热带植物园。所述的分子鉴定中，采用 CTAB 法提取真菌 DNA， PCR 扩增所用引物为 ITS1 和 ITS4 ； PCR 反应体系(25l)包括： 2.5l 10PCR缓冲液， 0.4l dNTP， 1.5l Mg2+， 1.5l ITS1， 1.5l ITS4， 0.2l Taq 酶， 15.4l ddH2O， 2l DNA 模板。扩增反应在 PCR 仪 Perkin Elmer 上进行，。

19、如下 PCR 循环： 94预变性 3min，循环 1 次； 94变性 1min， 51退火 1min， 72延伸 1min， 30 次循环；最后 72延伸 10min。PCR 扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序。 0025 虽然国内外都有专利和文献报道有关兰科植物种子萌发有效共生真菌的分离方法，但这些方法多采用从兰科植物野生植株的根中分离真菌。由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得种子萌发有效共生真菌的筛选和分离工作异常复杂和繁琐。同时，不同兰科植物根中的真菌与种子萌发阶段的有效共生真菌是否相同并不确定，要获得种子萌发有效共生真菌非常困难。对硬。

20、叶兰种子萌发有效共生真菌的分离和筛选尚无报道。本发明的方法硬叶兰原生地植株周围的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为培养基质，和硬叶兰的种子在实验室进行迁地共生萌发，诱导种子萌发产生原球茎，直接从收得到的硬叶兰原球茎中分离真菌，操作简单，获得的真菌种类单一，不需要大量繁琐的筛选过程，分离到的一种瘤菌根菌属真菌通过和硬叶兰种子的共生萌发实验，证明是硬叶兰种子萌发的有效共生真菌，从而为利用硬叶兰种子和真菌共生萌发来高效培育种苗开辟了一条新的途径。具体实施方式 0026 以下通过实施例对本发明作进一步地详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限制。所有基于本。

21、发明教导所作的变换，均应属于本发明的保护范围。 0027 实施例 1 ： 0028 硬叶兰开花时选取健壮的植株进行人工异交授粉，授粉后约 390 天果实成熟，采收已成熟但果荚尚未裂开的果实，表面用75的酒精消毒3-5分钟，并用无菌水清洗3-4次后用无菌刀片切开果实，将种子置于盛有硅胶的干燥器内干燥 24 小时后，于无菌的密闭玻璃小瓶内保存于 -20中。 0029 收集硬叶兰成年植株根部 20cm 范围内的枯枝落叶、树皮、苔藓和腐殖质等作为种子的培养基质。将收集的基质放在阴凉处自然风干后，用家用搅碎机加入无菌蒸馏水搅碎成基质碎沫。滤除碎沫中多余的水分，但保持其水分。

22、达到饱和状态。将湿润的基质碎沫分装在直径为 9cm 培养皿中，每个培养皿中基质含量约为培养皿容积的 1/2。将一片孔径为 45m，直径为 9cm 无菌圆形尼龙布盖在基质碎沫表面后，倾斜培养皿倒出多余的水分直到没有水滴自由流出。每个培养皿中的圆形尼龙布上再放置 10 块孔径为 45m，大小为 1cm1cm 的无菌尼龙网片，在每个尼龙网片上均匀播撒约 90 粒硬叶兰种子，将播种好的培养皿放入人工气候箱内进行培养。培养条件为：光照强度为 2000Lx-3000Lx，温度 25 2，光周期 12h/12h L/D。 0030 每周对种子进行观测，记录种子的萌发情况，培。

23、养 133 天后，记录每一阶段种子或原球茎的数量，并进行原球茎内生真菌分离实验。说明书 CN 102612965 B 5 4/4 页 6 0031 将原球茎用自来水冲洗后，在超净工作台中放入盛有有效氯离子浓度为 1的次氯酸钠溶液的烧杯中，轻轻摇动烧杯 3-5 分钟后，用无菌钝头镊子取出，再用无菌水冲洗 3-4 次。用无菌刀片将每个原球茎切成两半，切口面贴于准备好的马铃薯葡萄糖培养基 (PDA) 上进行培养。同时将 2 个表面消毒的原球茎不切开直接置于 PDA 培养基中，作为对照。培养皿用封口膜封好后放入人工气候箱内， 252黑暗培养。培养 7 天后，未切开的原。

24、球茎周围未长出菌丝，而切开的原球茎周围长出白色菌丝，由此可以确定为硬叶兰原球茎的内生真菌。 0032 原球茎切口处长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的 PDA 培养基上，转移 3-5 次后，得纯菌落。 0033 将保存的硬叶兰种子从 -20中取出，置于室温下过夜使种子回复室温。用有效氯离子浓度为 1的次氯酸钠溶液对种子进行灭菌并用无菌水漂洗 3-4 次后，将种子放入无菌水中制成均匀的悬浮液。在配制好的燕麦琼脂培养基 (OMA) 的培养皿表面放置两张 1.5cm4cm 大小无菌滤纸，分别吸取 150 微升种子悬浮液 ( 约 150 粒 ) 均匀的散。

25、布在两张滤纸条上。在培养基中心接种约 0.5cm3(1cm1cm0.5cm) 含有不同来源的单一共生真菌纯培养物的琼脂块，同时设置不接菌的对照处理组，每个处理 10 个重复，用封口膜密封后置于人工气候箱中培养培养条件为：光照强度为 2000Lx-3000Lx，温度 25 2，光周期 12h/12h L/D。 0034 培养 5 周后，接种从硬叶兰原球茎中分离到的 FCb4 菌株和接种从兜唇石斛原球茎中分离到的 FDaI7 菌株的种子都萌发了 ( 萌发率分别为 74.72 16， 69.82 12)。但接种FCb4菌株的实验组在阶段3、阶段4和阶段5三个阶段的种子数比。

26、率(分别为 29.30， 13.63， 12.04 ) 要高于接种 FDaI7 菌株实验组的种子数比率 ( 分别为 13.51， 1.36， 1.67 )，且在阶段 4 和阶段 5 存在显著性差异。说明 FCb4 菌株是对硬叶兰种子萌发以及原球茎发育有效的共生真菌。 0035 对 FCb4 菌株进行分子鉴定。采用 CTAB 法提取真菌 DNA， PCR 扩增所用引物为 ITS1 和 ITS4 ； PCR 扩增产物送到上海生工生物工程有限公司进行测序。将测序结果在美国国立生物技术信息中心数据库 (NCBI， http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中进行 BLAST 对比分析，所分离到的真菌均与登录号为AJ313440.1的真菌Epulorhiza sp.最为相似，最大相似度达到98，确定分离到的真菌为瘤菌根菌属(Epulorhiza)真菌。该菌种已采用试管斜面法保存于中国科学院西双版纳热带植物园。说明书 CN 102612965 B 6 。