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基于模拟炮制研究滇乌碱砂炒转化途径及其前后毒效变化

花匠小妙招
2025-05-05 07:28

毛茛科（Ranunculaceae）乌头属AconitumL.植物在全世界有300余种，广泛分布于北半球温带地区。我国分布有200余种，其中76种可供药用[1-2]；常用品种有乌头A. carmichaelii Debx.、北乌头A. kusnezoffii Reichb.、短柄乌头A. brachypodum Diels.和甘青乌头A. tanguticum(Maxim) Stapf等。该属植物中的主要成分为二萜生物碱，具有显著的生理活性，已开发出氢溴酸高乌甲素片、乙酰乌头碱片、草乌甲素片等镇痛类药物，用于缓解风湿痛、手术后疼痛等多种类型的疼痛[3]。

二萜生物碱也是乌头类药物的主要毒性成分，可引起严重的心律失常及呼吸中枢抑制，例如，乌头碱可与心肌细胞、神经细胞膜上的钠通道结合，使钠通道持续开放，钠离子内流增加，进而引起细胞膜电位失衡，导致心律失常、呼吸抑制等症状[4-5]。因此，为了确保用药的安全性，乌头类药物需要经过炮制，才能用于临床。常用的炮制方法包括：蒸法、煮法和砂炒法。前2种制法的炮制原理是：乌头碱型有毒生物碱的C-8位、C-14位酯键在炮制过程中依次发生水解，生成毒性较低的单酯型生物碱和醇胺型生物碱，如乌头碱转化为苯甲酰乌头原碱、乌头原碱[6]。课题组研究证实，相对于蒸法和煮法，砂炒法能够在更短的炮制时间内实现减毒目的，并且炮制原理与蒸法、煮法有明显区别，毒性生物碱的结构转化途径更为丰富[7-10]。

滇乌碱（yunaconitine）是短柄乌头、康定乌头A. tatsienense Finet & Gagnep.中的主要二萜生物碱，其结构与印乌碱、草乌甲素相似，区别在于C-3位、C-4′位的取代基不同。滇乌碱的C-4′位为甲氧基，印乌碱的C-4′位为氢原子；滇乌碱的C-3位为羟基，草乌甲素的C-3位为氢原子。这些结构差异对滇乌碱在砂炒过程中的结构转化过程及砂炒产物的毒性、活性会带来哪些影响，尚不清楚。

本实验以滇乌碱为例，以油浴的方式模拟砂炒炮制；采用色谱和波谱法对炮制产物进行分离鉴定，并通过药材砂炒品进行验证；采用急性毒性实验比较滇乌碱及炮制产物的毒性大小；采用乌头碱建立心律失常模型，明确炮制产物的抗心律失常活性，阐明砂炒过程中滇乌碱的结构转化途径及转化产物的毒性和抗心律失常活性，为乌头类药物的炮制原理研究及抗心律失常的药物研发提供思路。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BL-420F型多功能生理记录仪，成都泰盟软件有限公司；岛津LC-2010A型高效液相色谱仪，Lab Solutions色谱工作站，日本岛津公司；ULUP-I-10T型优普超纯水机，成都超纯科技有限公司；CPA2250型电子分析天平，德国Sartorius公司；HH-SJ型集热式磁力搅拌器，油浴用，金坛市城东新瑞仪器厂；MicrO-TOF-Q-II型质谱仪、Avance 600型核磁共振仪，瑞士Bruker公司；5型多功能炒货机，常州市金坛迈斯机械有限公司。

1.2 药品与试剂

滇乌碱（质量分数≥98.0%，本课题组从短柄乌头中分离得到）、pyroyunaconitine（质量分数≥95.0%，本课题组从滇乌碱砂炒炮制品中分离得到），通过1H-NMR、13C-NMR和高分辨电喷雾电离质谱（high resolution electrospray ionization mass spectroscopy，HR-ESI-MS）确定结构；乌头碱，批号WTZ10013，质量分数99.0%，陕西昊辰生物科技有限公司；8-去乙酰滇乌碱，批号DST230131-369，质量分数≥98.0%，成都德思特生物技术有限公司；盐酸普罗帕酮（批号101190-201702，质量分数99.8%）、盐酸利多卡因（批号100341-202104，质量分数93.1%），中国食品药品检定研究院；乌拉坦，批号2017090501，成都市科龙化工试剂厂；柱色谱硅胶，200～300目，青岛海洋化工厂；生理盐水，批号L122091801，四川科伦药业股份有限公司；乙腈，色谱纯，美国Fisher公司；水为超纯水；其余试剂均为分析纯；柱色谱所用石油醚沸点60～90 ℃；显色剂为碘蒸气。

短柄乌头由西藏林芝市藏医院提供，植物标本经成都中医药大学王毓杰副研究员鉴定，为短柄乌头A. brachypodum Diels.，凭证标本存放于成都中医药大学民族医药学院标本室。

1.3 动物

SPF级健康成年SD大鼠，雌雄兼用，7～8周龄，体质量（200±20）g；SPF级昆明小鼠，雌雄兼用，7～8周龄，体质量（18±2）g；均由北京斯贝福生物有限公司提供，生产许可证号：SCXK（京）2019-0010。实验前进行适应性喂养2 d，自由饮水及进食，室温维持在20～25 ℃，昼夜光照及通风环境自然调节，实验前禁食12 h。动物实验经成都中医药大学实验动物伦理委员会批准，伦理备案号为2020-15。

2 方法与结果

2.1 滇乌碱的测定

2.1.1色谱条件色谱柱为Supersil ODS-B柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈-0.03 mol/L碳酸氢铵溶液（浓氨水调pH 9.5），梯度洗脱：0～30 min，35%乙腈；30～70 min，35%～45%乙腈；70～90 min，45%乙腈；柱温35 ℃；检测波长260 nm；体积流量1.0 mL/min；进样量10 µL。

2.1.2对照品溶液的制备取滇乌碱约100 mg，精密称定，至250 mL量瓶，加二氯甲烷制成质量浓度为400.16 μg/mL的反应储备液，取4 mL该反应储备液，置10 mL量瓶中，挥干溶剂，加0.1%盐酸甲醇溶液定容，制得质量浓度为160.06 μg/mL的对照品溶液，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得对照品溶液。

2.1.3炮制品供试溶液的制备取圆底烧瓶24个，分为120、140、160、180 ℃4个温度组，每个温度下设置6个炮制时间点（1、5、10、20、30、40 min）。分别精密加入“2.1.2”项下反应储备液4 mL，挥干溶剂后，按照设置的温度、时间进行炮制，反应结束后，放冷，加0.1%盐酸甲醇溶液4 mL溶解，溶液转移至10 mL量瓶中，圆底烧瓶再加0.1%盐酸甲醇溶液洗2次，每次2 mL，洗液转移至同一10 mL量瓶中，加0.1%盐酸甲醇溶液定容至刻度，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得炮制品供试溶液。

2.1.4线性关系考察将准确称量的滇乌碱溶解在0.1%盐酸甲醇溶液中，制备线性储备液，质量浓度达到2 mg/mL。在每个10 mL量瓶中分别精密加入储备液0.025、0.100、0.200、0.400、0.800、1.000、2.000 mL，加0.1%盐酸甲醇溶液定容至刻度，以制备最终质量浓度为5、20、40、80、160、200、400 μg/mL的对照品溶液。将上述对照品溶液进样10 µL，按照“2.1.1”项下色谱条件，测定峰面积，并以进样质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），构建标准曲线，进行线性回归，得线性回归方程为Y＝119 56 X＋184 57，r＝0.999 7，结果表明，滇乌碱在5～400 µg/mL线性关系良好。

根据3倍和10倍信噪比（S/N）所对应的滇乌碱质量浓度，确定该方法的检测限为0.26 µg/mL，定量限为0.75 µg/mL。

2.1.5精密度试验精密吸取同一质量浓度为160.06 μg/mL的滇乌碱对照品溶液，进样量10 µL，连续进样6次，测定滇乌碱的峰面积，计算其RSD值为0.45%，表明仪器精密度良好。

2.1.6重复性试验取圆底烧瓶5个，分别加入“2.1.2”项下反应储备液4 mL，挥干溶剂后，于160 ℃下炮制10 min，反应结束后，放冷，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件分别进行测定，进样量10 µL，测定滇乌碱的峰面积，计算其质量分数的RSD值为2.59%，表明该方法的重复性良好。

2.1.7稳定性试验精密吸取同一供试品溶液（160 ℃下炮制10 min）于0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，进样量10 μL，测定滇乌碱的峰面积，计算其RSD值为2.35%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.1.8滇乌碱炮制前后含量测定分别吸取“2.1.2”项下滇乌碱对照品溶液和“2.1.3”项下不同炮制温度、不同炮制时间的供试品溶液10 µL，注入高效液相色谱仪，按照“2.1.1”项下色谱条件进行含量测定。从表1中可以看出炮制温度越高，时间越久，滇乌碱的含量变化越明显。例如，在160 ℃炮制5 min后含量降为106.79 µg/mL，160 ℃炮制30 min后含量降为14.79 µg/mL；180 ℃炮制5 min后含量降为7.78 µg/mL。

2.2 滇乌碱炮制转化参数筛选

分别吸取滇乌碱对照品溶液及不同炮制品供试溶液10 µL注入液相色谱仪，得到不同温度、不同时间条件下的色谱图，能够直观反映出滇乌碱及其炮制产物的含量变化过程，结果见图1、2。可知，炮制前的滇乌碱含量为160.06 µg/mL，在不同温度下，随着炮制时间的延长，滇乌碱的含量逐渐降低，并有新的色谱峰出现。温度越高，时间越久，滇乌碱及炮制产物的含量变化越明显。同时，从图1可以看出，滇乌碱在140～180 ℃，炮制5～40 min后，在保留时间24、38、72 min处有较明显的新色谱峰出现，提示在上述炮制温度和炮制时间条件下，滇乌碱有3个炮制产物。在160 ℃炮制30 min时，炮制产物的数量较多，含量较高，因此，本实验选择在该温度、时间条件下对滇乌碱的砂炒转化产物进行分离制备。

2.3 滇乌碱砂炒转化产物的分离及结构鉴定

2.3.1柱色谱样品的制备取滇乌碱1.49 g，置250 mL圆底烧瓶中，加适量二氯甲烷溶解，用旋转薄膜蒸发仪蒸干溶剂，使滇乌碱均匀地附着在圆底烧瓶内壁，将圆底烧瓶置于160 ℃下油浴30 min，取出，放凉，反应物加二氯甲烷溶解后，转移至蒸发皿中，挥干溶剂，得到滇乌碱炮制产物（1.35 g），供上柱用。

2.3.2分离纯化将滇乌碱炮制产物进行硅胶柱色谱（200～300目，130 g），分别用石油醚-丙酮-三乙胺10∶1∶0.01（2.2 L）、8∶1∶0.01（2.7 L）、6∶1∶0.01（4.2 L）、4∶1∶0.01（3 L）、2∶1∶0.01（2.1 L）、1∶1∶0.01（3 L）梯度洗脱，薄层板检视，合并相近流分后，得到A～C 3个组分。组分A（0.5 g）进一步采用硅胶柱色谱（200～300目，130 g）分离纯化，洗脱剂为石油醚-丙酮-三乙胺（6∶1∶0.01），得到砂炒产物1（200 mg）。

2.3.3滇乌碱砂炒产物的结构鉴定砂炒产物1：白色粉末，C33H45NO9。HR-ESI-MS m/z: 600.316 7 [M＋H]+（计算值600.316 7），从NMR谱（表2）中可以看出，砂炒产物1属于乌头碱型二萜生物碱[11]，具有1个-N-CH2-CH3(δH 1.07, 3H, t, J = 7.2 Hz; δH 2.56, 2.64, 各1H, m; δC13.5 q, 49.9 t)，4个甲氧基(δH 3.22, 3.27, 3.37, 3.29, 各3H, s; δC 56.4 q, 58.1 q, 57.2 q, 59.2 q)，以及1个对甲氧苯甲酰基(δH 7.98,2H, d, J = 8.4 Hz; 3.82, 3H, s; 6.88, 2H, d, J = 8.4 Hz; δC167.8 s, 122.8 s, 132.0 d (2C), 113.5 d (2C), 163.3 s, 55.4 q); δH 4.90 (1H, d, J= 3.0 Hz) 归属于H-14β，表明对甲氧苯甲酰基连接于C-14位[12-13]；HMBC远程相关谱表明：1-OCH3 (δH 3.22, s), 6-OCH3(δH 3.27, s), 16-OCH3(δH 3.37, s) 18-OCH3(δH 3.29, s) 分别与C-1 (δC 83.1, d), C-6 (δC83.6, d), C-16 (δC 83.5, d), C-18 (δC 76.6, t) 相连（图3）；从13C-NMR谱中可以看出砂炒产物1具有9个含氧碳信号，因此，除了对甲氧苯甲酰基和4个甲氧基外，该化合物还具2个羟基，HMBC谱也表明C-3 (δC 71.9, d) 与H-2 (δH2.17, 2.19), H-18 (δH3.67, 3.77)相关，C-13 (δC 77.6, s) 与H-9 (δH3.03), H-12β (δH 1.95), H-15 (δH 5.54) 相关。因此，这2个羟基分别位于C-3位和C-13位（表2）。

砂炒产物1与滇乌碱的NMR图谱相似，区别在于：（1）滇乌碱的C-8位有1个乙酰氧基，而该化合物在C-8位没有乙酰氧基；（2）13C-NMR中，滇乌碱的C-8、C-15的化学位移分别为85.5和39.6[14]，而砂炒产物1的C-8、C-15的化学位移分别向低场迁移到146.5和116.3。因此，1H-NMR中，δH5.54 (1H, d, J= 6.0 Hz) 归属为H-15，表明C-8和C-15之间形成了双键[15-17]。根据1H-NMR、13C-NMR及2D-NMR（HMBC、1H-1H COSY、NOESY）数据（表2），可以确定砂炒产物1的结构为N-乙基-8,15-双去氢-14α-[(4′-甲氧基)苯甲酰氧基]-1α,6α,16β,18-四甲氧基-乌头烷-3α,13β-二醇，即pyroyunaconitine。

2.4 短柄乌头药材砂炒品验证实验

2.4.1色谱条件色谱柱为Supersil ODS-B柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相为乙腈-0.03 mol/L碳酸氢铵溶液（浓氨水调pH 9.5），梯度洗脱：0～40 min，25%乙腈；40～80 min，25%～40%乙腈；80～100 min，40%～60%乙腈；100～120 min，60%～80%乙腈；柱温35 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长260 nm。

2.4.2对照品溶液的制备取砂炒产物1约20 mg，精密称定，至100 mL量瓶中，加0.1%盐酸甲醇溶液溶解，定容，制得质量浓度为207 µg/mL的对照品溶液，摇匀，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液，即得砂炒产物1对照品溶液。

取滇乌碱约20 mg，精密称定，至100 mL量瓶中，加0.1%盐酸甲醇溶液溶解，定容，制得质量浓度为200 µg/mL的对照品溶液，摇匀，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液，即得滇乌碱对照品溶液。

取8-去乙酰滇乌碱约5 mg，精密称定，至10 mL量瓶中，加0.1%盐酸甲醇溶液溶解，定容，制得质量浓度为520 µg/mL的对照品溶液，摇匀，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液，即得8-去乙酰滇乌碱对照品溶液。

2.4.3砂炒炮制品的制备将短柄乌头药材除去杂质、低温烘干后切制成长度为1～2 cm的段，以适量干净的河沙（粒度为10～24目，河沙用量以能够完全淹没药材为度），在滚筒式炒药机中加热至160 ℃后，投入切制好的药材，炒制10 min，转速为15 r/min。

2.4.4供试品溶液的制备取短柄乌头生品和砂炒品粉末（过7号筛）各2 g，精密称定，加氨试液2 mL和乙醚60 mL，混匀，放置过夜，滤过，药渣加乙醚40 mL，振摇1 h，滤过，药渣再加乙醚洗3次，每次20 mL，滤过，合并滤液和洗液，低温蒸干，残渣加三氯甲烷2 mL溶解，转入分液漏斗，用三氯甲烷3 mL洗容器，洗液并入分液漏斗中，用0.05 mol/L H2SO4提取3次，每次5 mL，合并酸液，酸液用三氯甲烷10 mL洗涤后，加氨试液调pH 至9左右，再用三氯甲烷提3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，三氯甲烷液用水20 mL振摇洗涤后，低温蒸干，残渣加0.1%盐酸甲醇溶液溶解，定容至5 mL量瓶中，作为短柄乌头药材生品和砂炒品供试溶液，摇匀，过0.45 µm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液[18]。

2.4.5短柄乌头生品和砂炒品中滇乌碱及炮制产物的测定分别吸取“2.4.2”项下滇乌碱、砂炒产物1和8-去乙酰滇乌碱对照品溶液10 µL和“2.4.4”项下短柄乌头生品和砂炒品供试溶液10 µL，注入高效液相色谱仪，按照“2.4.1”项下色谱条件进行检测。

2.4.6短柄乌头药材砂炒品验证结果滇乌碱在生品中的质量分数为349.12 µg/g，在炮制品中下降至5.00 µg/g。8-去乙酰滇乌碱在生品中的质量分数为125.01 µg/g，在炮制品中上升至196.49 µg/g，炮制品中还出现了pyroyunaconitine的色谱峰，质量分数为38.60 µg/g。结果表明在砂炒过程中，滇乌碱依次转化为8-去乙酰滇乌碱和pyroyunaconitine，结果见图4。

2.5 滇乌碱及其砂炒产物的毒性比较

2.5.1实验药物的配制

（1）空白溶剂的配制方法：取1%盐酸乙醇溶液4 mL，加生理盐水稀释，用5% NaOH调pH值至7左右，加生理盐水定容至100 mL。

（2）滇乌碱及砂炒产物1：取滇乌碱及砂炒产物1适量，加适量1%盐酸乙醇溶液溶解，生理盐水稀释，用5% NaOH调pH值至7左右，加生理盐水配制成不同质量浓度，充分混匀，备用。

2.5.2急性毒性实验按预实验结果选用SPF级昆明小鼠300只，雌雄各半，按体质量分层后随机分为30组。每个受试化合物分别设置5～8个剂量组（组间距r＝0.8～0.9），同时设置溶剂对照组。每只小鼠均按照0.015 mL/g尾静脉给药1次，分别观察给药后14 d内出现的中毒症状，死亡情况及死亡时间，对观察期满或中毒死亡的小鼠进行解剖，肉眼观察主要脏器的改变。

按Bliss方法计算动物的半数致死量（lethal dose 50%，LD50）及其95%的可信限。

2.5.3滇乌碱及砂炒转化产物的毒性比较结果课题组前期已完成印乌碱及其转化产物的心脏毒性研究，为了明确滇乌碱的C-4′甲氧基对急性毒性带来的影响，除了滇乌碱和pyroyunaconitine之外，本实验增加了印乌碱及其砂炒产物mithaconitine和Δ15(16)-16-demethoxyindaconitine的急性毒性研究。不同受试药物组小鼠在给药后大多数于1～10 min内死亡，所有动物均出现呃逆、舔足、流涎等症状，严重者可见跳跃、角弓反张、小便失禁。

Pyroyunaconitine组有部分小鼠出现口鼻、四肢及尾巴变红、便血、瞳孔变白的症状，少数动物解剖后出现胃部胀气、胸腔及肺部瘀血，其余器官无肉眼可见异常。不同受试化合物的LD50及95%可信限见表3。

2.6 砂炒产物1的抗心律失常活性研究

取SD大鼠98只，随机分为随机分为空白溶剂组、模型对照组、阳性对照组（普罗帕酮、利多卡因）、砂炒产物1不同剂量组（0.4、0.6、0.8 mg/kg）7组。空白溶剂的配制方法：取1%盐酸乙醇溶液4 mL，加生理盐水稀释，用5% NaOH调pH值至7左右，加生理盐水定容至100 mL。乌头碱、阳性药和受试药物均采用空白溶剂的配制方法进行配制。

SD大鼠ip 20%乌拉坦（剂量1.2 g/kg[19]）麻醉，仰位固定，针型电极插入四肢皮下，使用BL-420F多功能生理记录仪观察大鼠正常II导联心电图20 min后，暴露股静脉，从股静脉分别注射相应剂量的受试药物、阳性药和等体积空白溶剂，10 min后再从股iv乌头碱（0.03 mg/kg）建立心律失常模型[20-21]，记录30 min内各组大鼠第1次出现室性早搏（ventricular premature beat，VPB）的时间（VPB潜伏期）、是否出现心动过速以及心律失常的发生率。

实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，数据用表示。如果数据符合正态分布，并且方差齐者，采用单因素方差分析；如果数据符合正态分布，但方差不齐者，采用Tamhane’s T2检验。心动过速发生率和心律失常完全抑制率数据采用χ2检验判断发生频率的显著性。

2.6.1Pyroyunaconitine对乌头碱诱发大鼠VPB潜伏期的影响空白溶剂组大鼠在整个观察期内，心电图未见异常。模型组大鼠经股iv乌头碱后出现典型的室性早搏（ventricular premature beat，VPB）、室性心动过速（ventricular tachycardia，VT），并有一部分动物出现室颤（ventricular fibrillation，VF），持续30 min以上，表明心律失常模型建立成功。模型组的VPB潜伏期为（105.6±28.3）s，普罗帕酮组为（201.7±77.0）s，利多卡因组为（208.5±69.6）s；与模型组相比，2种阳性药均有显著性差异（P＜0.05）。Pyroyunaconitine不同剂量组（0.4、0.6、0.8 mg/kg）的VPB潜伏期分别为（187.1±93.7）、（229.5±77.8）、（419.1±166.1）s；与模型组相比，0.6 mg/kg和0.8 mg/kg剂量组均有显著差异（P＜0.05）；与普罗帕酮及利多卡因组相比，0.8 mg/kg剂量组有显著差异（P＜0.05），结果如表4所示。

2.6.2Pyroyunaconitine对乌头碱诱发大鼠VT发生率的影响如果VPB没有得到及时治疗，将会进一步发展为VT，VT的心电图特征为连续出现3次或3次以上的VPB，QRS波群宽大畸形，无恒定的P波[24]。VT发生率可用于评价药物的抗心律失常作用，VT发生率越低，抗心律失常作用越好。

χ2检验结果显示，3个剂量组之间的VT发生率无显著性差异（P＞0.05），但从表5中可以看出，随着剂量的增加，VT发生率逐渐降低（由0.4 mg/kg组的100%降为0.8 mg/kg组的56.5%）。

2.6.3Pyroyunaconitine对大鼠心律失常完全抑制率的影响心律失常发生率[25-26]是指大鼠预先注射受试药物，再用乌头碱建立心律失常模型后，30 min内出现心律失常（包括VPB、VT、VF）的比例。心律失常完全抑制率＝1－心律失常发生率，即30 min内未出现心律失常的比例，可以评价受试药物能否完全拮抗乌头碱的致心律失常作用。

根据χ2检验的要求，将受试药物的0.4 mg/kg和0.6 mg/kg 2个剂量组合并为0.4～0.6 mg/kg剂量组。总的卡方检验结果显示，0.4～0.6 mg/kg组、0.8 mg/kg组及利多卡因组的心律失常完全抑制率有差异（P＜0.05），结果如表6所示。两两比较结果显示，0.4～0.6 mg/kg剂量组的心律失常完全抑制率为4.2%，显著低于利多卡因组（P＜0.05）；0.8 mg/kg剂量组的心律失常完全抑制率为17.4%，与利多卡因组没有显著性差异（P＞0.05）。0.4～0.6 mg/kg剂量组与0.8 mg/kg剂量组的心律失常完全抑制率虽然没有显著性差异（P＞0.05），但随着剂量的增加，抑制率逐渐增大，呈现一定的量效关系。结果如表7所示。

3 讨论

通过HPLC法比较不同炮制温度、炮制时间条件下滇乌碱的结构转化情况，发现在160 ℃下炮制30 min时炮制产物的数量较多，含量较高。因此，选择该温度、时间条件制备滇乌碱炮制品，并采用柱色谱和波谱法，分离鉴定出炮制产物pyroyunaconitine。验证实验证实药材砂炒品中8-去乙酰滇乌碱的含量较生品增加，并且出现了pyroyunaconitine。与滇乌碱相比，pyroyunaconitine的C-8位没有乙酰基，C-8位和C-15位之间形成了双键；通过结构对比，可以推测出滇乌碱在炮制过程中的转化途径之一为：滇乌碱的C-8位酯键裂解，生成8-去乙酰滇乌碱；8-去乙酰滇乌碱的C-8位羟基和C-15位氢原子，发生脱水反应形成双键，生成pyroyunaconitine。反应过程如图5所示。

急性毒性实验结果显示滇乌碱的LD50为0.353 mg/kg，pyroyunaconitine的LD50为62.563 mg/kg，是滇乌碱的177倍；类似的，印乌碱的LD50为0.453 mg/kg，炮制产物mithaconitine和Δ15(16)-16- demethoxyindaconitine的LD50分别为42.323 mg/kg和9.013 mg/kg，是印乌碱的93倍和20倍。上述结果表明，炮制产物的急性毒性均远低于原型成分，不同结构的炮制产物相比，具有C-8和C-15位双键的炮制产物毒性更低，这与草乌甲素炮制产物pyrocrassicauline A的结果一致[9]。

滇乌碱和印乌碱的结构差异在于C-4′位取代基不同，从LD50值可以看出，滇乌碱的急性毒性大于印乌碱，表明4′-OCH3能够增加该类成分的毒性。滇乌碱和草乌甲素的结构差异在于C-3位取代基不同，草乌甲素的LD50为0.659 mg/kg[9]，大于滇乌碱的LD50值，表明该类型化合物的3-OH能够增加毒性。再结合印乌碱的LD50值可以进一步推测出，3-OH增加急性毒性的作用大于4′-OCH3。

抗心律失常活性实验采用乌头碱建立大鼠心律失常模型，其机制为乌头碱激活心肌细胞膜的钠通道，使其处于开放状态，钠离子内流增加，动作电位时程延长，引起心律失常。钠通道阻断剂分为Ia、Ib和Ic类。其中，Ib类的利多卡因和Ic类的普罗帕酮是临床常用的抗心律失常药物，可以阻断乌头碱的作用，广泛用于治疗室性早搏、室性心动过速等心律失常。因此，本实验选择了利多卡因和普罗帕酮作为阳性药。

以VPB潜伏期、VT发生率、心律失常完全抑制率作为评价受试药物抗心律失常活性的指标，VPB潜伏期和VT发生率均证实pyroyunaconitine具有较好的抗心律失常作用。与VPB潜伏期和VT发生率相比，心律失常完全抑制率更能直接反映出受试药物的抗心律失常作用强弱，抑制率越高，说明受试药物的作用越好。阳性药利多卡因组的抑制率为37.5%，与0.8 mg/kg组的17.4%没有显著性差异（P＞0.05），但显著高于0.40～0.60 mg/kg组的4.2%（P＜0.05）。综合考虑上述指标的结果，可以看出pyroyunaconitine的抗心律失常作用虽然弱于利多卡因，但是在延长VPB潜伏期方面具有一定的优势。本实验通过比较滇乌碱及pyroyunaconitine的结构，梳理出滇乌碱在砂炒过程中的结构转化途径。通过整体动物实验证实，pyroyunaconitine的毒性远低于滇乌碱，并有一定的抗心律失常作用。研究结果对于乌头类药物砂炒炮制原理的阐明、砂炒工艺的规范和质量标准的完善具有积极作用。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：刘丛改，陶培，郑清洋，陈佳佳，周园园，陈蓉，王毓杰．基于模拟炮制研究滇乌碱砂炒转化途径及其前后毒效变化 [J]. 中草药, 2023, 54(20): 6671-6681.