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黄花酢浆草提取物在治疗肾结石药物中的应用及提取方法

花匠小妙招
2025-05-11 06:22

1.本发明属于肾结石治疗药物技术领域，具体涉及黄花酢浆草提取物在治疗肾结石药物中的应用及提取方法。

背景技术：

2.肾结石是肾脏中的晶体物质或有机物质在导管腔中或腔性器官中浓缩沉淀，析出结晶并在局部聚集、生长形成的固体块状物。随着对结石的深入研究，发现结石是慢性肾脏疾病的风险因子。高盐等饮食习惯的改变增加结石的风险，相关研究表明，血脂异常会增加肾结石的患病风险相关，尤其是草酸钙(caox)结石患者；除此之外，结石的形成还与液体结晶、体液成分和含量相关，也与调控因子有关。进入21世纪以后，碎石机、纳米机器人等微创技术相关设备的出现和临床应用，使结石的治疗手段发生了历史性的变化。多种物理的体外碎石技术不能一劳永逸，且对机体损伤较大。目前研究发现，中草药治疗因其不会对人体造成创伤性损伤、不良反应少且经济易得，被广泛应用于泌尿系结石的治疗中。
3.黄花酢浆草(oxalis pes-caprae l.)始载于《本草纲目》；为酢浆草科酢浆草属植物，又名三叶草、酸叶草；是贵州省少数民族常用药材。在《中佤药》、《滇药录》中记载，黄花酢浆草全草能治疗赤白带下、跌打损伤、痈疡疔疽和风湿性关节炎等。《滇南本草》记载其能治疗久泻肠滑、久痢赤白、咽喉肿痛等。现代研究表明,黄花酢浆草主要含黄酮类、酚酸类、β-生育酚和生物碱等化学成分；具有清热解毒、凉血散淤、行气活血的功效，其提取物可用于蔬果保鲜、化妆品、保健品等方面。在中国,主要分布于华北、华中、华南及西南地区，由于其分布广泛、生存能力强且易获取等特点，因而具有较好的开发应用前景。
4.《云南民族药志》记载了黄花酢浆草治疗结石的偏方，但目前没有关于黄花酢浆草治疗结石的基础实验报告和有疗效的实验数据的相关报道。

技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
6.黄花酢浆草提取物在治疗肾结石药物中的应用；
7.优选的，所述药物包括胶囊剂、片剂及口服液；
8.本发明的另一目的在于提供黄花酢浆草提取物的提取方法，包括以下步骤：
9.s1：采集野外的黄花酢浆草茎和叶，清洗，晒干后，研磨制备黄花酢浆草粉末；
10.s2：将s1中的原材料粉末分别采用10倍量体积的水或其他溶剂回流提取，过滤，取第一次滤液；再采用8倍量体积的水或其他溶剂回流提取，过滤，取第二次滤液，合并两次滤液；
11.s3：将s2中的滤液在50℃条件下挥干溶剂，真空冷冻干燥后即得黄花酢浆草提取物；
12.优选的，所述黄花酢浆草提取物用于治疗结石引起的肾炎及肾结石；
13.优选的，所述溶剂为乙醇、甲醇、石油醚。
14.本发明的有益效果是：
15.1)所述结石治疗配方以单味草药为主要成分，制备方式简单，易于日常生活中操作实现；2)对草酸钙晶体损伤的肾近曲小管上皮有保护作用，并能抑制草酸钙晶体生长；3)有效抵御肾结石引起肾损伤，降低炎性细胞浸润；4)对肾脏细胞保护高于枸橼酸氢钾钠颗粒，对肾结石治疗效果趋近于枸橼酸氢钾钠颗粒。
附图说明
16.图1黄花酢浆草提取物对一水草酸钙晶体生长的体外抑制作用；
17.图2黄花酢浆草提取物对草酸钙晶体诱导损伤的hk-2细胞存活率的影响；
18.图3大鼠体重和肾脏系数；
19.图4黄花酢浆草提取物对t-sod活性和mda含量的影响；
20.图5黄花酢浆草提取物对pi、mg
2+
、ca
2+
、nag和尿蛋白含量的影响；
21.图6肾组织he染色和von-kossa染色(x20.0)，其中左边一列为he染色，右边一列为von-kossa染色。
具体实施方式
22.为了对本发明的技术方案及效果做出清楚完整的描述，通过以下实施例进行详细说明；
23.本发明实施例采用的枸橼酸氢钾钠颗粒及黄花酢浆草提取物剂量均为表面积剂量，具体大鼠体表面积计算公式为a＝k
·
w2/3(a 为表面积，单位m2；k为体型系数，新法中大鼠k值为0.086；w为体重，单位kg)本实施例用的剂量为一般剂量100mg/m2，按说明书所述“口服给药”。
24.枸橼酸氢钾钠颗粒是目前市面上流通的一种溶石和预防结石的治疗药物，它可以溶解尿酸结石，预防尿酸结石的形成，对于胱氨酸结石也有治疗效果。枸橼酸氢钾钠颗粒能够与尿酸钙结石、磷酸钙结石等含钙结石，竞争夺争性钙离子，使结石溶解变小，形成可溶性的枸橼酸钙盐，从而达到溶石、排石的作用。
25.实施例1
26.黄花酢浆草提取物制备
27.s1：采集野外的黄花酢浆草茎和叶，清洗，晒干后，研磨制备黄花酢浆草粉末；
28.s2：将s1中的原材料粉末分别采用10倍量体积的水或70％乙醇回流提取，过滤，取第一次滤液；再采用8倍量体积的水或70％乙醇回流提取，过滤，取第二次滤液，合并两次滤液；
29.s3：将s2中的滤液在50℃条件下挥干溶剂，真空冷冻干燥后即得黄花酢浆草提取物。
30.实施例2
31.黄花酢浆草提取物对草酸钙晶体生长的体外抑制作用
32.参考区淑蕴泽泻防治泌尿系结石的体外药理实验方案，利用火焰原子吸收分光光度计测定ca
2+
的浓度。按下式计算黄花酢浆草各提取物对草酸钙晶体生长的体外抑制指
数：
33.生长抑制指数(i)＝[1-(c0-ct)/c0]*100％
[0034]
c0为籽晶加入前滤液中ca
2+
的浓度，ct为籽晶加入后ca
2+
的浓度。
[0035]
实施例3
[0036]
黄花酢浆草提取物对com晶体诱导的hk-2细胞损伤的保护作用
[0037]
用含10％胎牛血清、1％青-链霉素的dmem/f12培养基培养细胞，置于37℃、5％co2湿度饱和的细胞培养箱中常规培养，选取对数生长期的细胞，接种于24孔板中，分为空白对照组、模型组、阳性药物组(2.5mmol/l)、水提取物组(0.1mg/ml、0.3mg/ml 0.5mg/ml)、醇提取物组(0.1mg/ml、0.3mg/ml 0.5mg/ml)，贴壁生长24h后加入相应试剂或药物，置于细胞培养箱中培养24h后采用mtt法检测细胞活力。
[0038]
实施例4
[0039]
黄花酢浆草提取物对大鼠草酸钙肾结石的治疗效果
[0040]
将健康雄性sd大鼠35只，随机分成7组，即空白对照组、草酸钙结石模型组、阳性药物组(枸橼酸氢钾钠颗粒，0.5g/kg)、黄花酢浆草水提取物中(0.6g/kg)、高剂量组(1.12g/kg)、黄花酢浆草70％乙醇提取物中(0.6g/kg)、高剂量组(1.12g/kg)，每组5只。第1天至第12天，空白对照组正常饲料饲养(15g/只/天)，其余各组每天给予含2％乙二醇和3％氯化铵的饲料饲养(15g/只/天)。第13天至 24天在上述基础上进行治疗(即治疗的同时继续食饵性造模)，空白对照组和草酸钙结石模型组以等体积的超纯水灌胃，其余各组按照对应剂量进行灌胃，每日一次，灌胃容积1ml/100g。大鼠控制饮水量， 30ml/只/天。实验期间每天称重(灌胃前),观察动物生长情况,以确定给药量。
[0041]
大鼠血清、尿液生化指标检测
[0042]
末次给药后，各组大鼠禁食12h，将大鼠分别放于自制简易接尿装置内接取大鼠尿液，采用试剂盒测定尿液中的尿蛋白含量。用水合氯醛麻醉，心脏取血，室温静置1h后3500r/min离心10min，取上清液按照试剂盒操作方法测定各组大鼠血清ca
2+
、mg
2+
、pi水平。
[0043]
大鼠肾脏结石观察与生化指标检测
[0044]
切取各组大鼠双肾，计算肾脏系数(双侧肾重/小鼠质量*100， g/100g)。一侧肾脏加入生理盐水(1g：9ml)匀浆，3500r/min离心，取肾组织匀浆上清液按照试剂盒测定肾组织ca
2+
、nag水平。另一侧肾脏用中性甲醛固定，送往武汉赛维尔生物科技有限公司包埋、切片、染色，观察各组大鼠肾组织病理改变及草酸钙结晶分布，对各组大鼠肾组织病理切片进行分析。
[0045]
数据统计与分析使用graphpad prism8软件对实验数据进行处理，与模型组比较采用单因素方差分析，以p《0.05为差异有统计学， *与模型组比较p《0.05；**与模型组比较p《0.01；***与模型组比较 p《0.001；
[0046]
如图1所示(control是以水为参照的空白对照组；co w是黄花酢浆草水提取物；co e是黄花酢浆草70％乙醇提取物)：黄花酢浆草水提取物和70％乙醇提取物均对草酸钙晶体的体外生长具有抑制作用；其中，黄花酢浆草水提取物对草酸钙晶体生长的体外抑制作用最强。
[0047]
如图2所示(control是空白对照组；model是com晶体模型组； uralyt-u是阳性药
物枸橼酸氢钾钠颗粒组；0.1mg/ml co w是 0.1mg/ml黄花酢浆草水提取物组；0.3mg/ml co w是0.3mg/ml黄花酢浆草水提取物组；0.5mg/ml co w是0.5mg/ml黄花酢浆草水提取物组；0.1mg/ml co e是0.1mg/ml黄花酢浆草70％乙醇提取物组； 0.3mg/ml co e是0.3mg/ml黄花酢浆草70％乙醇提取物组；0.5mg/mlco e是0.5mg/ml黄花酢浆草70％乙醇提取物组)：黄花酢浆草提取物对草酸钙晶体诱导的hk-2细胞损伤有保护作用。利用草酸钙晶体损伤hk-2细胞后，使细胞粘附晶体能力增强，从而使细胞存活率降低。mtt法检测显示，与空白组相比，其余各组细胞存活率均下降，加入黄花酢浆草提取物共培养后，细胞存活率显著提高，且高于枸橼酸氢钾钠颗粒组的56％；其中水提取物组的细胞存活率高于醇提取物组，0.5mg/ml黄花酢浆草水提取物组细胞存活率达79.65％；提示黄花酢浆草提取物可以抑制草酸钙晶体对hk-2细胞的损伤及降低晶体粘附能力。
[0048]
如图3所示(control是空白对照组；model是草酸钙结石模型组；uralyt-u是阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组；co wm是黄花酢浆草水提取物中剂量组；co wh是黄花酢浆草水提取物高剂量组；coem是黄花酢浆草70％乙醇提取物中剂量组；co eh是黄花酢浆草 70％乙醇提取物高剂量组)：黄花酢浆草提取物对食饵性结石大鼠具有治疗效果。整个实验过程中大鼠体重变化情况如图3a。分别为实验第0天、第6天、第12天、第18天、第24天各组大鼠体重变化情况。与空白组相比，其余各组大鼠的体重均下降，且灌胃治疗后体重的降幅相比于未灌胃时较平缓。图3b为大鼠肾脏系数。双侧肾质量与体重的比表示为g/100g。采用乙二醇和氯化铵诱导的草酸钙结石模型大鼠，肾脏会有不同程度的肿胀，相比于空白组，进行造模的大鼠的肾脏系数要高，表明食饵性造模后的大鼠发生实质性肾损伤；但各药物组的大鼠肾脏系数下降，其中酢浆草水提取物高剂量组的下降最明显，且趋近于阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组。
[0049]
如图4所示(control是空白对照组；model是草酸钙结石模型组；uralyt-u是阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组；co wm是黄花酢浆草水提取物中剂量组；co wh是黄花酢浆草水提取物高剂量组；coem是黄花酢浆草70％乙醇提取物中剂量组；co eh是黄花酢浆草 70％乙醇提取物高剂量组)：黄花酢浆草提取物对结石引起的肾脏氧化损伤具有保护作用。灌胃枸橼酸氢钾钠颗粒后较之模型组总超氧化物歧化酶(t-sod)活力上升，灌胃黄花酢浆草提取物后，水提取物中、高剂量组及70％乙醇提取物中、高剂量组较模型组t-sod活力上升，其中70％乙醇提取物高剂量组的t-sod活力略高于阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组(图4a)。灌胃黄花酢浆草提取物后，水提取物中剂量组丙二醛(mda)含量低于模型组，且效果优于阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组(图4b)。
[0050]
如图5所示(control是空白对照组；model是草酸钙结石模型组；uralyt-u是阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组；co wm是黄花酢浆草水提取物中剂量组；co wh是黄花酢浆草水提取物高剂量组；coem是黄花酢浆草70％乙醇提取物中剂量组；co eh是黄花酢浆草 70％乙醇提取物高剂量组)：黄花酢浆草提取物对肾结石具有治疗效果，且治疗效果与阳性药物持平。灌胃黄花酢浆草提取物后，醇提取物中剂量组的血清无机磷(pi)趋近于空白组(图5a)。黄花酢浆草水提取物高剂量组的血清镁(mg2+)含量较之结石模型组上升，趋近于空白组(图5b)。酢浆草醇提取物高剂量组的血清钙(ca2+)含量不仅低于模型组，还低于阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒(图5c)。黄花酢浆草醇提取物中剂量组的肾匀浆ca2+含量低于模型组，且趋近于阳性药物组(图5d)。黄花酢浆草水提取物中、高剂量组和醇提取物中
剂量组的β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶(nag)含量降低(图5e)。经给药治疗后，黄花酢浆草醇提取物中剂量组尿蛋白的含量趋近于阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组(图5f)。
[0051]
如图6所示(control是空白对照组；model是草酸钙结石模型组；uralyt-u是阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组；co wm是黄花酢浆草水提取物中剂量组；co wh是黄花酢浆草水提取物高剂量组；coem是黄花酢浆草70％乙醇提取物中剂量组；co eh是黄花酢浆草 70％乙醇提取物高剂量组)：黄花酢浆草提取物对肾结石大鼠的肾组织有保护作用。黄花酢浆草各提取物组与模型组和阳性药物枸橼酸氢钾钠颗粒组相比，肾小管扩张数量减少、程度减轻，炎性细胞浸润减少，炎症反应程度减轻，无结缔组织增生，减轻草酸钙结晶状态，降低肾结石的发生率。
[0052]
he染色和von-kossa染色结果显示，空白对照组大鼠肾脏的皮髓质分界清晰，肾小管排列紧密，肾小管上皮细胞着色均匀，形态正常，肾小球毛细血管丛清晰，未见草酸钙结晶(图6a，b)。结石模型组大鼠肾脏的皮髓质出现大量肾小管扩张，管壁变薄(箭头
①
)，皮质局部肾小管间质有少量结缔组织增生(箭头
④
)，伴有炎性细胞浸润(箭头
②
)，von-kossa染色可见草酸钙结晶(箭头
③
)(图6c， d)。阳性药物组大鼠肾脏的皮髓质分界清晰，只有少量肾小管扩张，管壁变薄(箭头
①
)，血管周围有少量炎性细胞浸润(箭头
②
)，髓质偶见肾小管囊状扩张，管腔内可见少量炎性细胞(箭头
③
)(图6e， f)。黄花酢浆草水提取物中剂量组大鼠肾脏的皮质区域肾小管扩张较多，管壁变薄(箭头
①
)，少量肾小管上皮细胞轻度肿胀，胞质疏松 (箭头
②
)(图6g，h)。黄花酢浆草水提取物高剂量组大鼠肾小管轻度扩张，管壁变薄(箭头
①
)，较多肾小管上皮细胞肿胀，胞质疏松(箭头
②
)(图6i，j)。黄花酢浆草醇提取物中剂量组大鼠肾小管轻度扩张，管壁变薄(箭头
①
)，皮质局部可见肾小管间质有少量炎性细胞浸润(箭头
②
)，von-kossa染色可见草酸钙结晶(箭头
③
)(图 6k，l)。黄花酢浆草醇提取物高剂量组大鼠少量肾小管轻度扩张，管壁变薄(箭头
①
)，血管附近少量炎性细胞浸润(箭头
②
)(图6m， n)。
[0053]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0054]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。