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中国医学科学院&中检院:整合空间代谢组学和网络毒理学研究何首乌组分的肝毒性机制

花匠小妙招
2025-05-15 17:09

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导读

何首乌(蓼科，PM)的肝毒性一直备受关注，但由于其多成分、多靶点的特点，相关的毒性物质和机制尚未被阐明。在以往的肝毒性筛查中，我们首先评估了PM的不同成分，发现在PM的70%乙醇提取物中，组分D（95%乙醇洗脱，PM-D）的肝毒性最强。此外，我们还确定了PM-D的主要成分，并基于斑马鱼胚胎模型评估了它们的肝毒性。然而，PM-D的肝毒性机制尚不清楚。本工作旨在通过整合网络毒理学和空间代谢组学策略来探索PM-D的肝毒性机制。我们基于八种关键毒性成分的毒性靶点预测和肝毒性靶点集，构建了PM-D的肝毒性相互作用网络，后富集关键信号通路，并进行分子对接验证，评估有毒成分与核心靶点的结合能力；采用小鼠肝组织病理变化和血清生化检测方法评价口服PM-D对小鼠的肝损伤作用；此外，空间代谢组学被用于分析PM-D处理后小鼠代谢谱的显著差异，筛选肝毒性相关生物标志物并分析代谢途径。质谱成像鉴别出处理后小鼠肝脏中PM-D代谢物高度分布。空间代谢组学显示，PM-D处理后代谢谱发生显著变化，牛磺酸、牛磺胆酸、腺苷和酰基肉碱等代谢物与PM-D诱导的肝损伤有关。代谢途径富集分析表明，亚麻酸和亚油酸代谢、肉碱合成、支链脂肪酸氧化等六种代谢途径发生显著变化。综合分析发现，PM-D引起的肝毒性与胆汁淤积、线粒体损伤、氧化应激和能量代谢、脂代谢紊乱等密切相关。结合分子对接等结果证明，本研究通过整合空间代谢组学和网络毒理学策略，全面鉴定了PM-D的肝毒性机制，为PM的毒性机制及其临床安全应用提供理论基础。

亮点：

1. 本研究测定了 PM-D 中关键成分的含量；

2. 网络毒理学是研究中药毒性机制的有效工具；

3. PM-D 的毒性代谢机制通过 MSI 技术可视化；

4. 提出了一种综合策略来研究中药的毒性机制。

论文ID

原名：Integrated spatially resolved metabolomic s and network toxicology to investigate the hepatotoxicity mechanisms of component D of Polygonum multiflorum Thunb

译名：整合空间代谢组学和网络毒理学研究何首乌组分的肝毒性机制

期刊：Journal of Ethnopharmacology

IF：5.195

发表时间：2022.08

通讯作者：靳洪涛，贺玖明，马双成

通讯作者单位：中国医学科学院和中国食品药品检定研究院

实验设计

实验结果

1. PM-D对肝损伤的影响

在急性毒性实验中，14天内所有剂量（包括5000 mg/kg的极限剂量）小鼠均未出现死亡或异常毒性症状。此外，大体解剖未发现明显的病理变化。然而，斑马鱼模型中PM-D的急性毒性探究结果显示出肝毒性。考虑到动物福利，我们以2000 mg/kg剂量重复处理7天后，通过病理生化检查评价PM-D对小鼠的肝损伤作用。PM-D处理后，我们测定了血清AST、ALT、TBIL、ALP水平作为肝损伤生化指标，也采集了肝组织进行组织病理学检查。与对照组相比，PM-D组肝细胞肿胀，肝窦轻度扩张，有少量微小肉芽肿，肝细胞轻度变性/坏死。血清生化分析显示AST活性和TBIL含量显著增加，ALT和ALP活性水平呈上升趋势（图1）。

表1 PM-D中具有代表性的有毒成分

图1 小鼠PM-D的组织学和肝功能变化

(A) 对照组小鼠肝组织的苏木精和伊红(H&E)染色(20×)。(B-D)药物组小鼠肝组织H&E染色(20×)；（B）肝细胞变性（黑色箭头）和坏死（红色箭头）；（C）肝细胞变性/坏死（红色箭头）和窦扩张（黑色箭头）；（D）肝微小肉芽肿（黑色箭头）。(E)血清生化标志物包括AST、ALT、TBIL和ALP。数据显示为平均值 ± SD（n = 6）。Mann-Whitney U检验，与对照组相比，**P < 0.01。

2. PM-D毒性成分的定量检测

PM-D中大黄素和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（HSW-YB-1）等蒽醌的含量分别为3,989.820 μg/g和12,677.423 μg/g。标准溶液和样品溶液的HPLC色谱图见图2。PM-D中trans-emodin-emodin dianthrone (HY-W-26)和cis-emodin-emodin dianthrone（HY-W-25）的二蒽酮含量分别为1,847.708 μg/g和1,455.940 μg/g。样品溶液和标准品的UHPLC-MS/MS的多反应监测（MRM）色谱图见图3，定量检测中二蒽酮的参数见表2。

表2 MRM分析中二蒽酮的参数

表3 PM-D肝毒性的关键成分与靶点的虚拟对接

图2 标准溶液(A)和样品溶液(B)的高效液相色谱图

大黄素-8-O-β-D葡萄糖苷(1)和大黄素(2)。

3.网络毒理学分析

3.1 PM-D在肝毒性中的靶标和网络分析

我们使用Comparative Toxicogenomics Database和Swiss Target Prediction Database筛选了八种成分的靶点，共确定了146个药物靶点。我们以“hepatotoxicity”和“liver toxicity”为关键词，确定了574个疾病靶点，并使用GeneCards、OMIM数据库删除了重复项。药物靶点和疾病靶点的交叉点被认为代表了PM-D肝毒性的候选靶点。我们总共确定了30个靶点，这些靶点以维恩图的形式呈现（图4A）。我们将上述数据放入Cytoscape 3.8.2中，绘制“成分-靶标-疾病”网络（图4B）。其中，大黄素和大黄酚有大量的靶点，在调控过程中发挥着重要作用。几乎所有靶点都与两种以上的活性成分相关，这表明PM-D的作用机制复杂多样。我们将30个交叉基因靶标导入STRING中，得到靶标相互作用网络关系数据，导出后使用Cytoscape 3.8.2软件绘制网络图（图4C）。CytoHubba分析结果显示mTOR、PIK3CA、AKT1、EGFR和ERBB2可能是主要靶点。

图3 标准溶液(A)和样品溶液(B)的质谱图

HY-W-26(1)和HYW-25 (2)。

表4 利用AFADESI-MSI鉴定差异代谢物

*在数据库中鉴定出具有精确MS/MS数据的代谢物。Delta (ppm) = (实测m/z-理论m/z)/理论m/z ×106。倍数变化：药物/对照组的MS峰强度比。

3.2 GO和KEGG富集分析

GO的过程主要集中在生物过程，主要涉及细胞内信号转导的调节、有机氮化合物代谢过程、TOR信号传导、细胞对内源性刺激的反应、对刺激反应的正调节、凋亡过程的调节和活性氧代谢过程。在细胞成分中，过程富集分析主要涉及细胞质、膜、TOR复合物、TORC1复合物和TORC2复合物。分子功能分析表明了与ATP结合、核苷酸结合、蛋白激酶活性和蛋白磷酸酶结合的关系（图5A）。KEGG富集分析主要涉及以下信号通路：PI3K-Akt、mTOR、HIF-1、AMPK、MAPK和Ras（图5B）。

图4 网络毒理学构建和基因靶点分析

(A) 用于筛选“共同靶点”的维恩图。(B) PM-D的“成分-靶点-疾病”网络。浅绿色节点代表靶点（基因），紫色节点代表成分，橙色节点代表疾病。节点大小是根据度值设置的。节点越大，药物成分与靶点的预测相关性越高。(C) PM-D诱导的肝毒性候选基因靶点的PPI网络。节点越红，相互作用中的基因越关键。

3.3 分子对接

分子对接适用于评估成分与靶标的结合能力。低结合能表明了配体-受体结合的构象稳定性。结合能低于0 kJ/mol，我们假设配体和受体可自由结合。结合能低于-5 kJ/mol（1.2 kcal/mol），被认为具有良好的亲和力。PM-D的有毒成分与PPI网络中选定的核心靶点对接。表3显示，大多数关键成分与关键靶点紧密结合。热图是根据组分和靶标的氢键结合能绘制的，表明HY-W-25、HY-W-26和HY-W-250的结合能低于其他组分（图6A）。因此，二蒽酮在肝毒性中发挥了更关键的作用。特别是，HY-W-26与mTOR和EGFR靶点，以及HY-W-250与mTOR靶点具有非常高的结合活性，其对接模式如图6B所示。

图5 GO功能富集分析二级分类直方图(A)和KEGG富集分析气泡图(B)

4.空间代谢组学分析

4.1 AFADESI-MSI的高成像性能

AFADESI-MSI可以显著提高周围环境中的长距离传输和电离效率，实现代谢物检测的高灵敏度和高覆盖率。从单个像素中提取的代谢物峰值可以达到数万种，包括许多代谢物（图7A）。如图7所示，质谱图像与扫描前同一切片的光学图像具有相同的微观结构，表明MSI提供了化合物的相对丰度信息，还原了生物组织切片的完整形态，保留了化合物的原位空间信息。在MSI同时检测外源性和内源性化合物的基础上，我们首先考虑了PM-D中与有毒成分相关的代谢物的检测和鉴定。根据代谢物的准确质量数和碎片离子比对，我们确定了两种药物成分代谢物，大黄素和大黄酚（补充表1），仅在药物组的肝脏中高度富集（图7B，C）。我们发现精氨酸和鸟氨酸等氨基酸特异地分布在肝边缘，而其他化合物在肝组织中的分布呈均匀分布（图7D）。此外，我们还鉴定了包括牛磺胆酸和牛磺脱氧胆酸在内的胆汁盐种类，这些化合物的空间分布相似，并且在局部斑块中高度富集，提示周围存在胆管（图7E）。

图6 PM-D成分与关键靶点的分子对接分析

(A)八种成分与关键靶点的结合能热图。较低的vina分数意味着较低的结合能，表明结合更稳定。(B) mTOR和HY-W-26的对接构象。(C) EGFR和HY-W-26的对接构象。(C) mTOR与HY-W-250的对接构象。

图7 ICR小鼠肝组织的AFADESI-MSI分析

(A)负离子模式下去除背景后的平均质谱图谱。(B-D) PM-D的外源性药物成分(B-C)和内源性代谢物(D)的代表性MS图像和相应的光学图像。MSI以全局模式显示。(E)胆盐的代表性质谱图像和相应的光学图像。使用强度阈值模式显示质谱成像以突出肝脏中的特定积累。

图8 PM-D处理后小鼠的代谢谱分析

(A-B) 正离子(A)和负离子(B)模式下的OPLS-DA分数图。(C-D)正离子(C)和负离子(D)模式下的排列测试。(E)差异代谢物的热图。(F)差异代谢物的PCA分析。

4.2 代谢谱分析和差异代谢物鉴定

我们进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）以揭示组间代谢物的差异（正离子：R2Y = 0.613，Q2 = 0.978；负离子：R2Y = 0.771，Q2 = 0.975），表明对照组和药物组之间存在显著差异（图8A，B）。为避免过度拟合，PLS-DA进行100次置换分析，所有排列后的R2和Q2值均低于原始值，且Q2点的回归线与纵轴相交低于零（正离子：R2 = 0.445，Q2 = - 0.504；负离子：R2 = 0.416，Q2 = -0.454），这表明PLS-DA模型可信并且没有过拟合（图8C，8D）。我们根据VIP值（阈值> 1）、P值（阈值 < 0.05）、FC值（阈值 > 1.2 或 < 0.8）和成像效果（强度> 1,000）选择差异代谢物。此外，差异代谢物的丰度变化在图8E中被描绘为热图，表明在施用PM-D后差异代谢物的丰度发生了显著变化。此外，差异代谢物的趋势和簇通过图8F中的主成分分析(PCA)可视化。基于代谢数据库的初步匹配和LC-MS/MS结构鉴定，我们获得了不同类别的代谢物，如氨基酸、甘油磷脂、脂肪酸和胆汁酸。代表性代谢物总结在表4中，相应的MS/MS数据在补充表2中展示。代表性差异代谢物的质谱图像如图9所示，表明精氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、肉碱、酰基肉碱、牛磺酸及其衍生物的代谢产物上调，脂质下调，这些代谢物可作为PM-D肝毒性的生物标志物。

图9 具有代表性的差异代谢物的质谱图像

m/z的平均峰强度为平均值±SEM。与对照组相比，***P < 0.001。

4.3 PM-D肝毒性的代谢途径分析

我们对不同的代谢物进行代谢途径分析，富集度排名前25的代谢途径如图10所示。我们综合分析差异代谢物在生理调节中的作用，基于通路富集的结果，我们构建了包括已鉴定的关键生物标志物的代谢网络，揭示了胆汁酸合成、嘌呤代谢、三羧酸循环、脂肪酸氧化和脂质代谢参与PM-D诱导肝毒性过程中的代谢变化（图11）。

图10 代谢途径的富集分析

使用SMPDB数据库获得的代谢途径富集图。

图11 代谢网络分析

显示关键代谢物丰度变化的代谢途径网络图。具有红色或绿色字体的代谢物分别代表显著的上调或下调。在MSI中，对照组在左侧，药物组在右侧。AMP，一磷酸腺苷；IMP，次黄嘌呤核苷酸；XMP，黄嘌呤核苷酸；GMP，鸟苷一磷酸；ROS，活性氧；DG，甘油二酯；MG，单酸甘油酯；PC，磷脂酰胆碱；PS，磷脂酰丝氨酸；PE，磷脂酰乙醇胺；PG，磷脂酰甘油；LPG，溶血-PG；PA，磷脂酸。

作为一种中药，PM已被广泛关注其肝毒性。PM引起的肝损伤通常是不可预测的，慢性肝病或炎症应激通常会导致对药物毒性的敏感性增加，从而引起更高的死亡率。由于我们缺乏对疾病生物标志物和机制的全面了解，PM引起肝毒性的预防、诊断和治疗研究仍十分具有挑战性。本研究选取PM中毒性最强的D组分作为研究对象，对其主要有毒成分的含量进行定量分析测定。我们进行了综合网络毒理学和空间分辨代谢组学分析，以评估负责PM-D效应的整体功效和代谢物，以及PM-D诱导的肝毒性机制。

基于对PM-D的初步成分鉴定和毒性筛选，8种成分可能是PM-D引起肝毒性的代谢物。因此，我们确定了关键有毒成分的含量，受到检测限的影响，并对四种化合物（大黄素、HSW-YB-1、HY-W-25和425 HY-W-26）进行了定量。根据网络毒理学中的节点度，AKT1、mTOR、EGFR、PIK3CA、ERBB2、KDR、ESR1、RPS6KB1、CTNNB1和GRB2是PM-D诱导肝毒性的潜在关键靶点。此外，我们进行了分子对接，结果表明PM-D的关键化合物与关键靶点具有较高的结合活性。在之前基于斑马鱼胚胎模型的PM-D关键有毒成分筛查中，与其他成分相比，二蒽酮在极低浓度下会引起肝毒性和胚胎死亡。二蒽酮的结合能，包括HY-W-25、HY-W-26和HY-W-250，均低于其他成分，这再次证实了二蒽酮可能与PM的肝毒性有关，也为进一步探讨二蒽酮的肝毒性机制提供了研究方向。

关键基因主要参与以下信号通路，包括mTOR、PI3K-Akt AMPK、MAPK、Ras和HIF-1。mTOR信号通路有助于调节肝脏代谢和肝损伤。TORC1复合物和TORC2复合物在脂质、葡萄糖和胰岛素稳态中发挥关键调节作用。AMPK、PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是mTOR的三个上游通路。PI3K/AKT/mTOR通路的抑制对肝毒性的机制有很大的影响。研究表明，2,3,5,4'- 2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-d-glucoside（PM的成分）的肝毒性可能是通过上调miR-122和抑制PI3K/Akt/mTOR通路，从而导致自噬介导的肝细胞凋亡，大黄素通过促进L02人肝细胞凋亡而表现出细胞毒性，并通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导自噬。MAPK信号通路与肝损伤有关，MAPK是对乙酰氨基酚致肝毒性的主要信号通路。二氯苯酚（三氯生）通过调节MAPK/p53信号通路引起斑马鱼肝损伤。在肝纤维化等慢性肝病中，Ras信号通路的激活和Ang II的产生可能导致血管收缩，促进氧化，并刺激组织炎症和纤维化。此外，Ras信号通路可促进细胞增殖、凋亡，参与脂质代谢，调节机体对外源性刺激的响应。HIF-1信号通路与能量代谢密切相关。HIF-1α可改变肝星状细胞对激活因子和趋化因子的敏感性，从而刺激胶原沉积和血管生成。

大鼠血浆代谢组学分析发现，PM引起肝损伤的机制可能与氨基酸、脂肪酸和能量代谢有关。PM所致肝损伤患者血浆代谢组学分析显示，其葡萄糖、氨基酸（缬氨酸、苯丙氨酸）和甘油磷脂代谢水平与自身免疫性肝炎和乙型肝炎有显著差异。研究人员采用代谢组学特征分析易感人群PM诱导的肝损伤特征风险，发现易感人群和耐受人群在甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、脂肪酸代谢、组氨酸代谢和芳香族氨基酸代谢方面存在显著差异。在我们的研究中，空间代谢组学可视化了肝脏中代谢物分布的变化。氨基酸（精氨酸和鸟氨酸）、胆汁酸代谢物（牛磺脱氧胆酸和牛磺胆酸）、肉碱代谢物（乙酰肉碱和丁酰肉碱）、脂质代谢物（脂肪酸和甘油单酯）和其他生物标志物在PM-D处理后发生显著变化，为PM致肝毒性的机理研究和临床诊断提供科学依据和数据支持。

胆汁淤积性肝损伤、肝细胞性肝损伤和混合性肝损伤是PM所致肝损伤患者最常见的病理特征。研究人员在摄入PM后的急性肝炎患者中发现了伴有胆汁淤积和肝细胞损伤的小叶门静脉炎症。胆汁酸是作为信号传导剂和炎症剂并促进肠道吸收的代谢物。胆汁酸代谢紊乱被发现是大鼠药物性肝损伤的早期疾病特征。胆汁酸已被提议作为药物性肝损伤临床诊断的早期预测因子。在合成次级胆汁酸并将其分泌到胆汁中之前，初级胆汁酸可以与甘氨酸（人类）或牛磺酸（小鼠）结合。PM-D处理后，牛磺酸结合物（如牛磺脱氧胆酸、牛磺胆酸和牛磺酸）的丰度显著增加。胆汁成分过多积聚可诱发胆汁淤积性肝损伤。

线粒体功能障碍和氧化应激是肝胆汁淤积发病的重要原因。嘌呤分子的分解代谢产生尿酸和活性氧 (ROS)。我们的研究结果表明，PM-D影响了嘌呤代谢途径，并诱导了嘌呤相关代谢物的上调，从而进一步促进了ROS释放的增加。GO富集还表明PM-D的毒性机制与ROS代谢过程有关。ROS可破坏线粒体膜电位，增加线粒体膜的通透性，抑制线粒体呼吸，破坏线粒体功能，从而导致细胞凋亡。此外，代谢途径的富集表明，PM-D毒性与肉碱合成、脂肪酸氧化和线粒体电子传递链有关。以上均表明PM-D诱导的肝毒性机制与能量代谢密切相关。线粒体是细胞能量产生的主要场所，线粒体功能障碍是引起肝毒性的普遍原因。TCA循环是负责能量产生的主要途径。中断的线粒体电子传递链会减少ATP的产生，导致细胞功能障碍甚至死亡。柠檬酸通常被认为是肝毒性的标志物。在这项研究中，我们发现柠檬酸的上调和TCA循环中间环节的阻断抑制了脂肪酸氧化和碳水化合物分解代谢，导致营养素的能量产生显著降低。ATP生成减少激活AMPK通路，该通路可以调节葡萄糖稳态、线粒体生物合成、脂质代谢和蛋白质合成。

脂肪酸氧化是产生能量的主要方式之一。在禁食期间，脂肪酸成为通过肝脏氧化产生能量的主要底物。虽然AMPK可以促进脂肪酸氧化，但NAD+的缺乏会阻止有效的β-氧化，无法发挥AMPK的相关作用。PM-D处理后，游离脂肪酸代谢物下调，肝脏中肉碱、酰基肉碱脂肪酸和戊二酸上调，表明PM-D导致脂肪酸代谢紊乱和线粒体功能障碍。线粒体脂肪酸β-氧化的损害可以抑制糖异生。因此，减少的糖异生和增加的葡萄糖利用弥补了脂肪酸氧化的障碍。我们的结果表明，PM-D处理后，葡萄糖丰度显著降低，磷酸烯醇丙酮酸增加。

脂质是活细胞的重要组成部分。例如，磷脂作为生物膜的主要成分，在细胞信号转导、细胞炎症和细胞凋亡、细胞迁移和增殖等方面发挥作用。在PM-D处理后，我们观察到不同的脂质种类下调，包括甘油磷酸胆碱、FAs、MGs、DGs、PGs、PCs和PEs。代谢组学结果表明，PM-D干扰了小鼠脂质代谢的稳态，相关脂质代谢水平显著降低，这也出现在马兜铃酸和镉引起的肝毒性中。因此，临床研究表明，SMs、PCs、LPCs、TGs和CEs下调可能被认为是肝硬化相关的脂质标志。先前研究人员采用基于LC/MS的脂质组学研究NASH模型小鼠也发现几种磷脂含量减少，表明生物膜损伤和线粒体功能障碍，这与我们的研究结果一致。另一项研究在体外使用HepG2细胞来表征暴露于肝毒性化合物期间的代谢特征，与氧化应激相关机制有关的代谢失衡包括脂肪酸减少、酰基肉碱脂肪酸增加和DG减少，这与我们在本研究中的结果一致。

肝脏是清除血液中氨的核心器官，可通过鸟氨酸循环将有毒的氨合成为无毒的尿素。我们还发现PM-D破坏了氨基酸的代谢，包括鸟氨酸、亚精胺、天冬氨酸和精氨酸，这表明PM-D导致了氨基酸代谢途径的损害。精氨酸在鸟氨酸循环中代谢产生尿素，部分氨基酸转化为离子氨，通过肾脏排泄。长期服用生药PM后，血氨向尿素的转化功能降低，血氨蓄积可导致肝损伤加深。先前的研究已经证实，精氨酸代谢变化与大鼠急性肝损伤有关，缬氨酸水平可能反映肝功能的变化，可作为肝损伤的生物标志物。在机理探索中，空间代谢组学分析仅使用单一剂量，不能反映毒性反应-剂量关系，多剂量生物标志物的变化趋势仍有待揭示，这是这项研究的一个缺点。由于中药靶点的复杂性和代谢物生物过程的丰富性，我们的结果需要通过动物和细胞模型进一步验证。本研究提出了网络毒理学与MSI技术相结合的策略，为中药毒性机制研究提供了新的技术和方法论支持。

结论

在这项研究中，我们利用网络毒理学和空间代谢组学阐明了有毒PM-D的肝毒性机制。在鉴定出PM-D中的八种主要毒性成分后，网络毒理学预测了以免疫调节和炎症为中心的重要药理作用。网络毒理学预测了涉及AKT1、mTOR、EGFR、PIK3CA、ERBB2、KDR、ESR1、RPS6KB1、CTNNB1和GRB2的关键靶点。空间代谢组学鉴定和表征PM-D的成分，并检测到PM-D的肝毒性生物标志物，包括氨基酸、胆汁酸、脂质等。基因富集和代谢网络的综合分析表明，PM-D的毒性机制可能是氧化应激、线粒体损伤导致胆汁酸代谢、嘌呤代谢、能量代谢和脂质代谢紊乱。本研究确定了关键有毒成分的含量，为研究PM的肝毒性提供了依据，再次证明网络毒理学和空间代谢组学可用于阐明中药毒性机制中的关键代谢物，特别是对于成分相对明确的中药及中药提取物而言。

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35987407/

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