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与茄子果实颜色紧密连锁的SNP分子标记及应用

花匠小妙招
2025-06-17 16:32

与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记及应用
技术领域
1.本发明涉及分子遗传育种技术领域，尤其涉及与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记及应用。

背景技术：

2.茄子(solanum melongena l.)是重要的茄科蔬菜，具有重要的经济价值和保健价值。我国是茄子第一生产国，茄子年产量占全世界产量的60％左右。茄子果实颜色是茄子重要的商品性状，存在丰富的变异，且我国不同地域消费习惯对茄子果实需求存在明显差异。常见紫红色茄子主要是由果皮中的花青素决定，其颜色深浅与花青素的含量密切相关。
3.随着高通量测序技术的成熟发展,特别是大量的snp(单碱基扩增多态性)标记的开发、应用高密度遗传图谱的方法开展植物性状基因定位成为挖掘植物基因的热点之一。利用高通量测序技术开发大量的snp标记，开发性状连锁的分子标记进行品种的初期筛选，达到分子辅助育种的目的，可大大缩短育种的周期提高育种效率。
4.目前，利用传统育种方法进行茄子果实颜色性状的育种是较为耗时费力的，一般要等到茄子开花结果之后才能知道商品茄子的果实颜色，育种周期较长，期间也需要投入较大的工作量；并且，进行茄子果皮花青素调控基因定位，筛选紧密连锁的分子标记，开发与茄子果实花青素调控基因紧密连锁的分子标记，建立早期辅助选择技术体系，对茄子颜色育种的遗传改良具有重要意义，现有技术还未有效实现。
5.为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记及应用。

技术实现要素：

6.本发明的目的是提供与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记及应用，本发明对茄子果实花青素调控基进行qtl定位，并筛选到与果实花青素调控基因紧密连锁的分子标记位点，为10号染色体95538422和98266374snp位点，两标记间的物理距离为2.61m。通过两个分子标记可以预测茄子果实颜色，为茄子果实颜色选育种的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位时间、减少育种工作量和提高育种效率。
7.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
8.与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记，所述snp分子标记包括snp分子标记ⅰ和snp分子标记ⅱ；所述snp分子标记ⅰ包含seq id no.1所示的核苷酸序列，且所述seq id no.1所示的核苷酸序列自5’端起第51位碱基是snp位点ⅰ；所述snp分子标记ⅱ包含seq id no.2所示的核苷酸序列，且所述seq id no.2所示的核苷酸序列自5’端起第51位碱基是snp位点ⅱ；
9.所述snp位点ⅰ和snp位点ⅱ分别位于茄子10号染色体的第95538422位碱基和第98266374位碱基，所述第95538422位碱基为c或t；所述第98266374位碱基为c或t；
10.所述seq id no.1为tacatcagtgcatagtttcatttgagttgatatttcgtatacagtgtttc
[c/t]tgccttatatattcaatacattatctcgtactgatgtcccttacggggga；
[0011]
所述seq id no.2为gattataatatgagaaatcgaacattcattaataataataaataaaagtt[c/t]aaataatcaactgattaaactattaagaaagttgatttagcctattacaa。
[0012]
本发明还提供了与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记的检测方法，具体步骤如下：
[0013]
s1、提取所述snp分子标记的核苷酸序列；
[0014]
s2、将步骤s1的核苷酸序列中的snp分子标记通过引物设计软件转化为kasp标记；
[0015]
s3、将步骤s2转化得到的整体核苷酸序列，通过基因分型检测平台，进行基于kasp的snp基因分型检测。
[0016]
进一步地，所述kasp所在的反应体系包含kasp引物混合物、kasp主混合物和dna模板；所述kasp引物混合物包括正向引物f-1、正向引物f-2和反向引物；所述kasp主混合物包括正向引物f-1尾部fam标记的寡序列、正向引物f-2尾部hex标记的寡序列、fam染料、hex染料和淬灭剂；所述dna模板为茄子基因组dna。
[0017]
进一步地，用于检测snp分子标记ⅰ的kasp标记引物核苷酸序列为：正向引物f-1为gaaggtgaccaagttcatgcttttttagtgcatcccaaaaagaatgtc；正向引物f-2为gaaggtcggagtcaacggatttgagttgatatttcgtatacagtgtttct；反向引物r为acatcagtacgagataatgtattgaatatataag。
[0018]
进一步地，用于检测snp分子标记ⅱ的kasp标记引物核苷酸序列为：正向引物f-1为gaaggtgaccaagttcatgcttcgaacattcattaataataataaataaaagttc；正向引物f-2为gaaggtcggagtcaacggattaaatcgaacattcattaataataataaataaaagttt；反向引物r为gctaaatcaactttcttaatagtttaatcagttgat。
[0019]
本发明还提供了与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记的应用，将所述snp分子标记应用于茄子果实颜色性状的早期鉴定和筛选。
[0020]
进一步地，将所述snp分子标记应用于选育高花青素含量的辅助育种。
[0021]
进一步地，将所述snp分子标记的分子探针或引物应用于制备检测花青素含量的试剂盒。
[0022]
本发明还提供了一种茄子辅助育种的方法，检测snp分子标记的类型，根据snp基因分型确定茄子品种花青素含量高低。
[0023]
通过上述技术方案，与茄子果实花青素调控基因紧密连锁的snp分子标记，其分子标记定位于茄子10号染色体上，snp分子标记ⅰ包含seq id no.1所示的核苷酸序列，seq id no.1所示的核苷酸序列自5’端起第51位为碱基是snp位点，其碱基为c/t；当该snp位点ⅰ在等位基因中的碱基为c时，茄子果实颜色为紫红色，花青素含量高，当该snp位点ⅰ在等位基因中的碱基为t时；茄子果实颜色为白色，花青素含量低。
[0024]
snp分子标记ⅱ包含seq id no.2所示的核苷酸序列，seq id no.2所示的核苷酸序列自5’端起第51为碱基是snp位点ⅱ，其碱基为c/t；当该snp位点在等位基因中的碱基为c时，茄子果实颜色为紫红色，花青素含量低，当该snp位点ⅱ在等位基因中的碱基为t时；茄子果实颜色为白色。
[0025]
综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明对茄子果实花青素调控基进行qtl定位，并筛选到与果实花青素调控基因紧密连锁的分子标记位点，为10号染色体95538422和
98266374snp位点，两标记间的物理距离为2.61m。通过两个分子标记可以预测茄子果实颜色，为茄子果实颜色选育种的早期鉴定和筛选提供分子辅助选择技术支持，同时大大缩短了传统基因定位时间、减少育种工作量和提高育种效率。
附图说明
[0026]
图1是本发明实施例的突变体(l6-5)、野生型果实表型(a)和花青素含量(b)图；
[0027]
图2是本发明实施例f1代果实颜色与野生型一致的照片；
[0028]
图3是本发明实施例的f2代杂交群体果色分离情况；
[0029]
图4是本发明实施例的茄子花青素基因初步定位结果图；
[0030]
图5是本发明实施例的snp分子标记ⅰ的基因分型结果；
[0031]
图6是本发明实施例的snp分子标记ⅱ的基因分型结果；
[0032]
图7本发明实施例的花青素调控基因的定位区间示意图。
具体实施方式
[0033]
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：
[0034]
本发明专利下述实施例中使用方法和装置，如无特殊说明，均为常规方法和装置；所用器材、试剂均为试剂公司购买的常规器材和试剂。
[0035]
实施例：与茄子果实颜色紧密连锁的snp分子标记，其定位和应用步骤如下：
[0036]
一、ems突变体构建及遗传分析
[0037]
1.供试植物材料
[0038]
利用ems诱变紫红色茄子自交系，获得稳定遗传的白茄突变体，该突变体的果皮白色，总花青素含量显著降低，如图1所示。将该突变体连续多代自交获得纯合自交系，将白茄突变体和紫红茄野生型回交后，产生f1代，如图2所示，表型正常，均为紫红茄，表现为隐性遗传。图1为野生型(wt)、突变体茄子(l6-5)和f1代茄子照片。f1代茄子自交获得f2代茄子，利用f2代种子构建f2代分离群体，观察f2代茄子果实颜色，统计f2代茄子果实颜色分比，进行遗传规律分析，并对白色茄子性状进行定位。野生型wt果实为紫红色，花青素含量高；ems突变体(l6-5)果实颜色为白色，花青素含量低。
[0039]
2.f2代果色遗传规律分析
[0040]
如图3所示，本方法中构建的f2代分离群体共346株，田间性状统计结果显示，茄子果色为白色的有85株，茄子果色为紫红色的有261株。卡方检测果色呈白色和紫红色的x2＝0.035＜x20.05.1＝3.84，符合分离比3:1，但是由于茄子紫红色深浅并不一致，因此推测茄子果色性状可能受多基因隐性遗传控制。
[0041]
二、花青素调控基因的初步定位
[0042]
1.样品采集
[0043]
利用构建的f2代果色分离群体，选取紫红色茄子30株叶片构建混池w-pool，选取白色茄子30株混池m-pool，同时采集野生型(wt)和白茄突变体(l6-5)的幼叶用于bsa集群分离分析。
[0044]
2.bsa集群分离分析
[0045]
本研究前期委托广州基迪奥生物技术有限公司，对混池w-pool，m-pool，wt，l6-5
pool两个亲本分别检测到1545825个snp、1765226个snp，其中转换和颠换类型分别有985143个snp和984489个snp、377408个snp和376477个snp。
[0055]
两个亲本样品的纯合位点分别有561147个snp、900796个snp，杂合位点分别有253855个snp、272367个snp，其杂合snp位点约占总snp位点的31.15％、23.22％，两个混合池样品的纯合位点分别有381057个snp、380588个snp，杂合位点分别有981494个snp、980378个snp，其杂合snp位点约占总snp位点的72.03％、72.04％，说明f2群体与参考基因组之间的差异较小，而两个亲本与参考基因组的差异较大。
[0056]
表2四个样品的snp统计
[0057][0058][0059]
(3)snp注释
[0060]
变异位点在参考基因组上的位置以及参考基因组上的基因位置信息，得到变异位点在基因组发生的区域，以及变异产生的影响。同义突变是指碱基被替换之后，产生了新的密码子，但由于生物的遗传密码子存在简并性，新旧密码子仍是同义密码子，所编码的氨基酸种类保持不变。若所编码的氨基酸种类发生改变，则是非同义突变。
[0061]
由表3、表4可知，m-pool中的基因间区共检测到1188355个snp，外显子区有24374个snp，内含子区有基因内有68364个snp，其中非同义突变15109个，同义突变8784。w-pool中的基因间区共检测到1187770个snp，内含子区有基因内有68245个snp，外显子区有24333个snp，其中非同义突变15164个，同义突变8793个。
[0062]
表3 snp基因组位置信息统计
[0063][0064]
表4 snp编码信息
[0065][0066][0067]
4.采用欧式距离(euclidean distance，ed)算法关联初步定位基因差异区间
[0068]
采用欧式距离(euclidean distance，ed)算法，是利用测序数据寻找混池间存在显著差异标记，并以此评估与性状关联区域的方法。利用ed方法计算关联值，取ed的2次方作为关联值，对ed值进行拟合，如图3所示。按照99％分位数筛选获得的显著区间及区间内的候选基因。包含基因的关联区域在第10号染色体上86000001～99540000之间，区域大小为12.91mb，有609个候选基因。
[0069]
图4为ed值在染色体上的分布图。横坐标为染色体名称，散点代表每个snp位点的ed值，线ⅰ为拟合后的ed值，线ⅱ代表0.95显著性关联阈值，线ⅲ代表0.99显著性关联阈值。
[0070]
三、花青素调控基因的精细定位
[0071]
kasp-pcr反应在abiq6plus荧光定量pcr仪上进行，使用384孔pcr板，反应体系6μl：其中1μl dna(60ng﹒μl-1
)，3μl kasp master mix(2
×
)，0.45μl引物混合物(由浓度为10μmol-1
f_fam、f_hex和r按照1:1:1的体积比混合得到)，ddh2o补足至6μl。
[0072]
反应程序：第一阶段94℃变性15min；第二阶段94℃变性20s，61℃退火60s，共10个循环(从第2个循环开始，每个循环降低0.6℃)；第三个阶段94℃变性20s，55℃退火60s，共26个循环；第四阶段37℃降温保持1min。
[0073]
引物序列：用于基因分型的snp分子标记ⅰ的引物序列为：
[0074]
正向引物f-1:5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctagttgatatttcgtatacagtgtttcc-3’；正向引物f-2：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatttgagttgatatttcgtatacagtgtttct-3’；反向引物r：acatcagtacgagataatgtattgaatatataag-3’。
[0075]
用于基因分型的snp分子标记ⅱ的引物序列为：
[0076]
正向引物f-1：5
’‑
aaggtgaccaagttcatgcttcgaacattcattaataataataaataaaagttc-3’；正向引物f-2：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattaaatcgaacattcattaataataataaataaaagttt-3’；反向引物r：5
’‑
gctaaatcaactttcttaatagtttaatcagttgat-3’。
[0077]
采用kasp基因分型技术，对f2代分离群体进行基因定位，如图7所示，定位在两个snp标记snp分子标记ⅰ和snp分子标记ⅱ之间，其中snp分子标记ⅰ位于smel3ch10的95538422，snp分子标记ⅱ位于smel3ch10的98266374，区间从91.11到93.71mb，距离2.6mb，其中snp分子标记ⅰ的核苷酸序列为tacatcagtgcatagtttcatttgagttgatatttcgtatacagtgtttc[c/t]tgccttatatattcaatacattatctcgtactgatgtcccttacggggga，其中[]标记的c
→
t的变化(即自5’端起第50位碱基的snp位点碱基为c或t)。
[0078]
snp分子标记ⅱ的核苷酸序列为gattataatatgagaaatcgaacattcattaataataataaataaaagtt[c/t]aaataatcaactgattaaactattaagaaagttgatttagcctattacaa，其中[]标记的c
→
t的变化(即自5’端起第50位碱基的snp位点碱基为c或t)。
[0079]
用于检测snp分子标记ⅰ的kasp标记引物核苷酸序列为：
[0080]
正向引物f-1为gaaggtgaccaagttcatgcttttttagtgcatcccaaaaagaatgtc；正向引物f-2为gaaggtcggagtcaacggatttgagttgatatttcgtatacagtgtttct；反向引物r为acatcagtacgagataatgtattgaatatataag。
[0081]
用于检测snp分子标记ⅱ的kasp标记引物核苷酸序列为：
[0082]
正向引物f-1为gaaggtgaccaagttcatgcttcgaacattcattaataataataaataaaagttc；正向引物f-2为gaaggtcggagtcaacggattaaatcgaacattcattaataataataaataaaagttt；反向引物r为gctaaatcaactttcttaatagtttaatcagttgat。
[0083]
snp分子标记ⅰ包含seq id no.1所示的核苷酸序列，seq id no.1所示的核苷酸序列自5’端起第51位为碱基是snp位点，其碱基为c/t；当该snp位点ⅰ在等位基因中的碱基为c时，茄子果实颜色为紫红色，花青素含量高，当该snp位点ⅰ在等位基因中的碱基为t时；茄子果实颜色为白色，花青素含量低。
[0084]
图5是snp分子标记ⅰ的基因分型结果,a表示与紫色野生型wt纯合表型，c表示与白色突变体l6-5纯合表型，b表示是杂合表型。
[0085]
snp分子标记ⅱ包含seq id no.2所示的核苷酸序列，seq id no.2所示的核苷酸序列自5’端起第51为碱基是snp位点，其碱基为c/t；当该snp位点ⅱ在等位基因中的碱基为c时，茄子果实颜色为紫红色，花青素含量低，当该snp位点ⅱ在等位基因中的碱基为t时；茄子果实颜色为白色。
[0086]
图6是snp分子标记ⅱ的基因分型结果，a
′
表示f2群体中与紫色野生型wt纯合表型，c
′
表示f2群体中与白色突变体l6-5纯合表型，b
′
表示f2群体中的杂合表型。
[0087]
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。