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与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的SNP分子标记、KASP检测引物及应用

花匠小妙招
2024-12-11 22:18

本发明涉及花椰菜花球表型的分子标记，尤其涉及与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记、kasp检测引物及其在鉴定或检测花椰菜花球分枝表型中的应用，属于花椰菜花球分枝表型的snp分子标记及其应用领域。

背景技术：

1、与其他芸薹属蔬菜相比，花椰菜(brassica oleracea var.botrytis l.)最显著的特征是其独特的食用器官“花球”。花椰菜花球的分枝长度是花椰菜关键的农艺性状，也是影响花椰菜产量、品质和松紧性的关键因素。研究花椰菜花球分枝长度形成的分子基础并开发紧密连锁的分子标记，对花椰菜资源评价和创制以及新品种培育具有重要意义。

2、随着高通量测序技术的快速发展，单核苷酸多态性(snp)标记因其成本相对较低、产量高、稳定性和重现性好、在基因组中分布均匀、易于检测等优点逐渐成为最受欢迎的选择。其中，kasp平台具有高精度、高通量和成本效益的优点，已广泛应用于小麦、水稻、棉花、黄瓜和西兰花等多种农作物的遗传多样性分析、指纹图谱构建、全基因组关联分析、种子纯度或真实性鉴定以及分子标记辅助育种等领域。

3、目前，关于花椰菜花球分枝长度的研究尚处于qtl定位层面，有限的报道将花椰菜花球花梗长度相关基因定位在花椰菜2号和6号染色体上，cn106399498 a公开了一种花椰菜花球花梗长度的分子标记辅助选择方法,其通过酶切反应和电泳检测的方法实现花椰菜花球花梗长度的鉴定，不仅通量较低，且操作过程复杂繁琐。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记；

2、本发明的目的之二是提供检测或扩增所述与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记的kasp检测引物；

3、本发明的目的之三将所述的与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记或检测或扩增所述与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记的kasp检测引物应用于花椰菜花球分枝表型的检测或预测；

4、本发明的目的之四是提供一种检测花椰菜的花球分枝表型的方法；

5、本发明的目的之五是提供一种检测花椰菜的花球分枝表型的pcr检测试剂盒。

6、为实现上述目的，本发明所采取的主要技术方案包括：

7、本发明的一方面是提供了与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记(chr8:11387967)，其核苷酸序列为花椰菜参考基因组‘c-8’8号染色体，其snp位点位于11387967核苷酸处，该处碱基为g或a；其中，该snp位点的基因型为g：g时，该基因型对应的表型为短花球分枝表型；该snp位点的基因型为g：a或a：a时，该基因型对应的表型为长花球分枝表型。

8、本发明的另一方面是提供了检测与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记(chr8:11387967)的kasp检测引物，所述kasp检测引物由正向引物、反向引物和通用引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列为seq id no.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列为seq id no.2所示，所述的通用引物的核苷酸序列为seq id no.3所示。

9、本发明所提供的与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记或检测与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记(chr8:11387967)的kasp检测引物均能应用于检测花椰菜样品的花球分枝表型是短花球分枝表型还是长花球分枝表型。

10、本发明的再一方面是提供一种检测花椰菜的花球分枝表型的方法，包括：

11、(1)提取待检测花椰菜样品的基因组dna；

12、(2)根据与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记或检测与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记(chr8:11387967)设计kasp检测引物；

13、(3)以提取的待检测花椰菜样品的基因组dna为模板、以所设计的kasp检测引物为pcr引物建立荧光pcr扩增体系；通过kasp平台分析样品pcr产物的荧光信号来鉴定待检测花椰菜样品snp位点的基因型；如果待检测花椰菜样品snp位点的基因型为g:g基因型，该待检测花椰菜样品的花球分枝表型为短花球分枝表型；如果待检测花椰菜样品的snp位点的基因型为g：a或a：a，该待检测花椰菜样品的花球分枝表型为长花球分枝表型。

14、本发明的一种优选的具体实施方案，所述的kasp引物由正向引物、反向引物和通用引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列为seq id no.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列为seq id no.2所示，所述的通用引物的核苷酸序列为seq idno.3所示。

15、本发明的再一方面是提供了一种检测花椰菜的花球分枝表型的pcr检测试剂盒，包括：pcr mix、kasp检测引物，其中，所述的kasp引物由正向引物、反向引物和通用引物组成，所述的正向引物的核苷酸序列为seq id no.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列为seq id no.2所示，所述的通用引物的核苷酸序列为seq id no.3所示。

16、在本发明的前期研究中，采用全基因组关联分析、选择性清除分析以及单倍型分析等组学手段，确定了位于花椰菜8号染色体79kb的控制花椰菜花球分枝长度的关键qtl区间，筛选并克隆了候选基因，开发了与花球分枝长度紧密连锁的分子标记并设计了用于高通量检测该分子标记的kasp引物。

17、本发明利用全基因组关联分析、选择性清除分析、转录组以及单倍型分析等组学手段，确定了位于花椰菜8号染色体79kb的控制花椰菜花球分枝长度的关键qtl区间，基于花椰菜参考基因组chr8:11387967变异位点在开发了一种snp分子标记，其与花球分枝长度紧密连锁，从而能够快速、准确、高通量的鉴定花椰菜花球分枝长度。

技术特征：

1.与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的snp分子标记，其特征在于，其核苷酸序列位于花椰菜参考基因组‘c-8’8号染色体，其snp位点位于11387967核苷酸处，该处碱基为g或a。

2.根据权利要求1所述的snp分子标记，其特征在于，当所述snp位点的基因型为g：g时，该基因型对应的表型为短花球分枝表型；当所述snp位点的基因型为g：a或a：a时，该基因型对应的表型为长花球分枝表型。

3.检测或扩增权利要求1或2所述snp分子标记的kasp检测引物。

4.根据权利要求3所述的kasp检测引物，其特征在于，所述kasp检测引物由正向引物、反向引物和通用引物组成；其中，所述的正向引物的核苷酸序列为seq idno.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列为seq id no.2所示，所述的通用引物的核苷酸序列为seq id no.3所示。

5.权利要求1或2所述的snp分子标记在检测或鉴定花椰菜花球分枝表型中的应用。

6.权利要求3所述的kasp检测引物在检测或鉴定花椰菜花球分枝表型中的应用。

7.一种检测花椰菜的花球分枝表型的方法，其特征在于，包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的kasp引物由正向引物、反向引物和通用引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列为seq id no.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列为seq id no.2所示，所述的通用引物的核苷酸序列为seq id no.3所示。

9.一种检测花椰菜的花球分枝表型的pcr检测试剂盒，包括：pcr mix、kasp检测引物，其特征在于，所述的kasp检测引物是根据权利要求1或2所述的snp分子标记设计得到的kasp检测引物。

10.根据权利要求9所述的pcr检测试剂盒，其特征在于，所述的kasp检测引物由正向引物、反向引物和通用引物组成，其中，所述的正向引物的核苷酸序列为seq id no.1所示，所述的反向引物的核苷酸序列为seq id no.2所示，所述的通用引物的核苷酸序列为seq idno.3所示。

技术总结
本发明公开了与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的SNP分子标记、KASP检测引物及应用。本发明基于花椰菜高世代自交系材料的重测序数据，利用GWAS、选择性清除和单倍型分析等方法开发出与花椰菜花球分枝长度紧密连锁的SNP分子标记，其位于花椰菜参考基因组‘C‑8’8号染色体，该SNP位点位于11387967核苷酸处，该处碱基为G或A，当基因型为G：G时，其对应表型为短花球分枝表型；当基因型为G：A或A：A时，其对应表型为长花球分枝表型。根据SNP分子标记设计KASP检测引物，对花椰菜材料进行基因型鉴定，表明该SNP分子标记与花椰菜花球分枝长度紧密相关，能够快速、准确、高通量的鉴定花椰菜花球分枝长度。

技术研发人员：杨迎霞,姚星伟,陈锐,孙德岭,程文娟,吴建金,张金良,郭俞彤,吕明杰,王倩
受保护的技术使用者：天津市农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/9/26