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一种菊花分枝性状关联分子标记的获得方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-20 11:50

技术领域

本发明公开了一种菊花分枝性状关联分子标记的获得方法，属于生物技术领域，用于菊花分枝性状优良基因的定位和克隆及菊花新品种的培育。

背景技术

菊花是我国十大传统名优和世界四大切花之一，在花卉生产和园林绿化中占有重要地位。近年来，关于菊花株型、花器等观赏性状遗传研究较多，在一定程度上推动了菊花杂交育种进程。但随着育种工作的不断深入，传统的杂交育种方法因耗时较长，且无法定向改良特定性状，在育种中存在一定局限性。分子标记辅助选择育种为菊花育种工作提供了新的研究思路。

随着分子标记技术的发展，连锁遗传图谱构建与数量性状基因定位（quantitative trait loci，QTL）研究已经在月季、杜鹃、百合、康乃馨等许多观赏植物中陆续展开。目前，关于菊花观赏性状相关的分子标记位点也有相关报道，但是菊花分枝性状关联分子标记的获得方法尚未见报道。

切花的品质主要由花型、花期和株型等性状决定，而分枝性状是菊花观赏性状——株型的重要构成因素，也是菊花品种改良的主要目标性状之一。进一步理解切花菊分枝性状的遗传机制，并获得控制分枝性状的主效QTL，可为菊花分枝性状的分子标记辅助育种创造条件。本发明将获得的与菊花分枝性状相关联的分子标记，为菊花新品种选育、分枝性状相关基因的精确定位和克隆奠定了理论基础。

参考文献：

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发明内容

针对目前菊花分枝性状优质基因的精确定位和克隆的研究在国内外几乎空白这一现状，本发明的目的是：筛选出一个或多个与菊花分枝性状基因紧密关联的分子标记，建立菊花分枝性状分子标记辅助选择体系，从而提高菊花优良分枝性状的选择效率，为菊花新品种选育奠定基础。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种菊花分枝性状关联分子标记的获得方法，包括以下步骤：

a试验材料及其表型数据的获得：供试材料为保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”的菊花品种。第一年选择分枝性状差异明显的两个菊花品种进行人工杂交，获得F1杂交种子，次年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗于4月中下旬单株标号后定植于“中国菊花种质资源保存中心”，常规管理同大田。分别于第二年和第三年秋季初花期调查亲本和F1群体植株的分枝性状，单株重复3次，并计算两年性状调查的平均值。利用Microsoft Excel2007软件和SPSS15.0软件对分枝性状在两个年份的表型数据分别进行基本描述性统计分析。

b菊花连锁图谱构建：

1）采用CTAB微量法提取亲本及其F1杂交后代基因组DNA；

2）利用杂交亲本对SRAP和SSR引物组合进行多态性筛选，将筛选出的多态性引物组合用于作图群体的多态性扩增并统计扩增后的多态性条带数据；

实验用的Lambda DNA、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及100bp DNA marker（100、300、500、700、1000、1500、2000bp）购自宝生物工程（大连）有限公司，SRAP和EST‐SSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

SRAP‐PCR反应体系与反应程序：SRAP‐PCR反应混合液总体积为10μl，其中包括10×PCR buffer，3mM Mg2+，200μM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，10μM SRAP引物和25ng模板DNA。SRAP‐PCR反应程序：预变性94℃/5min；变性94℃/1min，退火复性35℃/1min，延伸72℃/1min，5个循环；变性94℃/1min，退火复性50℃/1min，延伸72℃/1min，35个循环；延伸72℃/7min；结束反应，10℃保存。SRAP‐PCR产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后拍照保存。SSR‐PCR反应体系与反应程序：SSR‐PCR反应混合液总体积为25μl，其中包括2.5μl10×PCR buffer，1.5μl25μM Mg2+，2μl2.5mM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，SSR引物各2μl，模板DNA50ng。SSR‐PCR反应程序：扩增条件:94℃预变性3min；94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸50s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3）运用JoinMap4.0软件，选用‘CP作图模型’设置LOD为4.0，分别对双亲的分离位点进行连锁分析，获得双亲的分子标记连锁群，再用Mapchart2.2软件绘制连锁图。

c菊花分枝性状的QTL定位：基于步骤b已经构建的分子遗传图谱并结合步骤a得到的表型数据，运用Win QTL Cartographer v2.5软件及复合区间作图法进行菊花分枝性状QTL分析，并估算各QTL的加性效应及其对表型变异的贡献率等遗传参数。相关运行参数如下：Walk speed=2cM；Window size=10.00；Model=6。取LOD阈值为2.5，当LOD峰值大于2.5时即可确定该处存在一个显著QTL位点，置信区间根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值来确定。QTL命名基本遵照McCouch等（1997）方法并稍作改动：性状英文缩写名称（首字母大写）+环境（E1，E2）+连锁群的序号。例如，“PbnE1Q1”表示利用2011年（E1）表型数据在连锁群Q1上检测到的关于一级分枝数（Pbn）的数量性状基因位点。

d菊花分枝性状关联分子标记的确定：

根据步骤c所得的主效QTL所在的标记区间即可确定与菊花分枝性状紧密关联的分子标记。

根据步骤c所得的主效QTL所在的标记区间确定的与菊花分枝性状紧密关联的分子标记为：与一级分枝数紧密关联的分子标记为PbnE1N4，其对应的引物对为SSR338和SSR63，引物对SSR338序列为：SEQ ID NO.1/SEQ ID NO.2，引物对SSR63序列为：SEQ ID NO.3/SEQ ID NO.4；同一级分枝数，分枝高度关联分子标记为Bh E1N11，其对应的引物对为SSR185和Me3Em15，引物对SSR185序列为：SEQ ID NO.5/SEQ ID NO.6，引物对Me3Em15序列为：SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.8；与一级分枝长度关联的分子标记为PblE1N15，其对应的引物对为SSR341、Me4Em3、Me3Em8、Me20Em4和Me21Em5中的任意一对，引物对SSR341序列为SEQ ID NO.9/SEQ ID NO.10，引物对Me4Em3序列为SEQ ID NO.11/SEQ ID NO.12，引物对Me3Em8序列为SEQ ID NO.7/SEQ ID NO.13，引物对Me20Em4序列为SEQ ID NO.14/SEQ ID NO.15，引物对Me21Em5序列为SEQ ID NO.16/SEQ ID NO.17。

有益效果本发明选用的是以‘QX‐145’（P1）为母本、‘南农银山’为父本（P2）杂交获得的92株F1分离群体为试材，利用SRAP和SSR分子标记构建了双亲的分子遗传连锁图谱，获得菊花分枝性状的主效QTL及与其紧密关联的分子标记。与目前技术相比，其优点是：

（1）SSR标记为共显性标记，多态性好，重复性高，覆盖整个基因组，具有多等位基因的特性，是构建遗传连锁图谱较理想的分子标记。SRAP标记的正反引物分别针对基因组的内含子和外显子区域设计，与SSR标记的扩增区域互补，可以作为SSR标记补充标记，有效地增加图谱的密度和基因组覆盖率，其多态性和效价比（产生多态性的效率/成本）都很高。

（2）分子标记辅助育种，克服菊花分枝性状优良基因型鉴定的困难。选择范围更广，强度更大。菊花的常规选育方法周期长，费时又费力。通过本发明构建了菊花的遗传连锁图谱，为菊花观赏性状的QTL定位奠定了基础；菊花分枝性状关联分子标记的获得可以实现优良品种提早选择，减少工作量，大大提高菊花新基因型的选择效率，从而加快育种进程。

附图说明

图1基于SRAP和SSR测交标记位点的菊花品种‘QX‐145’的连锁遗传图谱

图2基于SRAP和SSR测交标记位点的菊花品种‘南农银山’的连锁遗传图谱

图3与菊花各分枝性状显著相关联的QTL在遗传图上的分布

具体实施方式

实施例1

（一）试验材料及其表型数据的获得

供试材料为保存于南京农业大学“中国菊花种质资源保存中心”的切花菊品种‘QX‐145’和‘南农银山’。两品种的部分分枝性状差异明显。2010年秋，以‘QX‐145’为母本，‘南农银山’为父本进行人工杂交。选取母本‘QX‐145’发育良好的花蕾，在舌状花刚露色时去雄，用硫酸纸袋套袋，同时将父本‘南农银山’的花序套袋。待母本柱头伸出并开叉呈锐角和分泌黏液时，收集已套袋父本的新鲜花粉，用毛笔对母本进行授粉、套袋，次日重复授粉。当花梗变黄枯萎时采集授粉花序，脱粒，获得92粒F1杂交种子，次年3月初经穴盘点播，连同亲本扦插苗于4月中下旬单株标号后定植于“中国菊花种质资源保存中心”，常规管理同大田。

将92株F1实生苗以扦插的方式获得无性系，分别于2011和2012年秋季初花期调查亲本和F1群体植株的分枝性状，包括一级分枝数、分枝高度和一级分枝长度3个性状，单株重复3次，并计算两年性状调查的平均值。具体统计方法参照李鸿渐等的方法（《中国菊花》，1993）。利用Microsoft Excel2007软件和SPSS15.0软件对分枝性状在两个年份的表型数据分别进行基本描述性统计分析（见表1）。

表1菊花‘QX-145’，‘南农银山’及其F1群体的分枝性状在2011～2012年度的描述性数据

（二）菊花连锁图谱构建

1）参照CTAB微量法（Murray & Thompson，1980）提取亲本及其F1杂交后代基因组DNA，Lambda DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度和质量，最后将浓度调至50ng·μL‐1；

2）利用杂交亲本分别从375对SRAP和38对SSR引物组合（Zhang et el.,2011;Wang et el.,2013,引物序列见表2，表3）中进行多态性筛选，筛选后的多态性引物组合（59对SRAP和38对SSR引物组合）用于作图群体的多态性扩增并统计扩增后的多态性条带数据。

表2用于菊花作图群体进行多态性分析的SRAP引物名称及其序列

注：SRAP引物序列来自于已公开文献（Zhang et el.,2011），a为在Li&Quiros（2001）文中收集的引物序列。

表3用于菊花作图群体进行多态性分析的SSR引物名称及其序列

注：SSR引物序列来自于已公开文献（Wang et el.,2013）。

对于共显性标记，根据多态性标记电泳图像谱带，用a、b分别表示亲本的带型，用h表示杂合带型，用u表示数据缺失。对于显性标记，若母本有带，父本无带，则有带记为d，无带记为b；若父本有带，母本无带，则有带记为c，无带记为a，用u表示数据缺失。以引物名称作为多态性位点的名称，如果同一个引物扩增出多个多态性位点，则在引物或引物组合名称后按照分子量从大到小为序标注阿拉伯数字作为后缀以示区别。根据多态性位点在父母本中的分离情况，加适当前缀以便作图时参考：多态性位点只出现在杂交母本‘QX‐145’中，则加前缀“Q”；多态性位点只出现在杂交父本‘南农银山’中，加前缀“N”。对只存在于亲本之一（Testcross marker，测交标记位点）的多态性标记位点，按照1:1孟德尔分离比例在0.05显著水平进行卡方检验。最后所得标记数据见表4。

表4多态性分子标记在菊花作图群体中的分离分析

SRAP‐PCR反应体系与反应程序：SRAP‐PCR反应混合液总体积为10μl，其中包括10×PCR buffer，3mM Mg2+，200μM dNTPs，0.5U Taq DNA聚合酶，10μM SRAP引物和25ng模板DNA。SRAP‐PCR反应程序：预变性94°C/5min；变性94°C/1min，退火复性35°C/1min，延伸72°C/1min，5个循环；变性94°C/1min,退火复性50°C/1min，延伸72°C/1min，35个循环；延伸72°C/7min；结束反应，10°C保存。SRAP‐PCR产物采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后拍照保存。SSR‐PCR反应体系与反应程序：SSR‐PCR反应混合液总体积为25μl，其中包括2.5μl10×PCR buffer，1.5μl25μM Mg2+，2μl2.5mM dNTP，0.5U Taq DNA聚合酶，SSR引物各2μl，模板DNA50ng。SSR‐PCR反应程序：扩增条件:94°C预变性3min；94°C变性40s，56°C退火30s，72°C延伸50s，35个循环；72°C延伸5min，4°C保存。扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

实验用的Lambda DNA、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及100bp DNA marker（100、300、500、700、1000、1500、2000bp）购自宝生物工程（大连）有限公司，SRAP和SSR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；实验中使用的主要仪器有Eppendorf5810R型高速冷冻离心机、DYY‐6C型电泳仪、PTC‐100TM型PCR仪、JS‐380型凝胶成像分析仪。

3）利用所得的329个标记位点，运用JoinMap4.0软件，选用‘CP作图模型’设置LOD为4.0，分别对双亲的分离位点进行连锁分析，获得双亲的分子标记连锁群，再用Mapchart2.2软件绘制连锁图。

‘QX‐145’遗传图谱含有109个标记位点，剩余51个标记位点没有连锁到遗传图上，标记位点的作图率为68.1%。‘QX‐145’的遗传图由25个连锁群组成（图1），平均图谱距离为13.4cM，期望基因组为2159.5cM，本发明实际获得‘QX‐145’遗传图谱累积长度为1456.6cM，其基因组覆盖率约为67.9%。

‘南农银山’遗传图谱含有125个标记位点，剩余44个标记位点没有连锁到遗传图上，标记位点的作图率为73.9%。‘南农银山’的遗传图由21个连锁群组成（图2），平均图谱距离为11.6cM，期望基因组为1452.1cM，本发明实际获得‘南农银山’遗传图谱累积长度为1982.7cM，其基因组覆盖率约为73%。

（三）菊花分枝性状的QTL定位

基于步骤（二）已经构建的分子遗传图谱并结合步骤（一）得到的表型数据，运用Win QTL Cartographer v2.5软件及复合区间作图法进行菊花各分枝性状QTL的分析，并估算各QTL的加性效应及其对表型变异的贡献率等遗传参数（见表5）。相关运行参数如下：Walk speed=2cM；Window size=10.00；Model=6。取LOD阈值为2.5，当LOD峰值大于2.5时即可确定该处存在一个显著QTL位点，置信区间根据LOD值的峰值两侧各下降1个LOD值来确定。QTL命名基本遵照McCouch等（1997）方法并稍作改动：性状英文缩写名称（首字母大写）+环境（E1，E2）+连锁群的序号。例如，“PbnE1Q1”表示利用2011年（E1）表型数据在连锁群Q1上检测到的关于一级分枝数（Pbn）的数量性状基因位点。

表5菊花各分枝性状在2011和2012两个年度的QTL定位分析

注：*P<0.05；**P<0.01。

针对一级分枝数，2011年检测到的PbnE1N4与2012年检测到的PbnE2N4位于‘南农银山’遗传图N4连锁群上的标记区间相同（N‐SSR338‐6_N‐SSR63‐4），说明其应为同一个QTL；由于其可以解释一级分枝数表型变异的贡献率为14.66%‐15.52%。因此，PbnE1N4（PbnE2N4）应为受环境影响较小的主效QTL。

针对分枝高度，2011年检测到的Bh E1N11与2012年检测到的Bh E2N11均在N11连锁群上N‐SSR185‐4_N‐Me3Em15‐1标记区间，说明其应为同一个QTL；其可以解释分枝高度表型变异的贡献率为10.74%‐18.37%，因此Bh E1N11（Bh E2N11）应为受环境影响较小的主效QTL。

针对一级分枝长度，2011年检测到的PblE1Q1与2012年检测到的PblE2Q1均位于Q1连锁群上的Q‐Me3Em8‐3_Q‐Me20Em4‐2和Q‐Me20Em4‐2_Q‐Me21Em5‐8*标记区间，两个标记区间相邻，应该属于同一个QTL位点，说明该位点受环境因素影响较小；PblE1Q1（PblE2Q1）在2011年和2012年两种环境中的贡献率分别为7.98%和14.80%，说明该QTL为主效QTL；PblE1N15与PblE2N15同分布在‘南农银山’遗传图的N15连锁群的N‐Me4Em3‐4_N‐SSR341‐2标记区域，说明在两种环境中检测到是相同的QTL位点，其受环境的影响也比较小，该位点在两年中的贡献率为10.69%‐24.38%，也是主效QTL。

（四）菊花分枝性状关联分子标记的确定

根据步骤（三）所得的主效QTL所在标记区间即可确定与菊花分枝性状紧密关联的分子标记（见表5，图3）。

针对一级分枝数，PbnE1N4（PbnE2N4）位于‘南农银山’遗传图N4连锁群上的标记区间相同（N‐SSR338‐6_N‐SSR63‐4），则标记SSR338（SSR338F：SEQ ID NO.1/SSR338R：SEQ ID NO.2）和SSR63（SSR63F：SEQ ID NO.3/SSR63R：SEQ ID NO.4）与一级分枝数紧密关联；同一级分枝数，分枝高度关联分子标记为SSR185（SSR185F：SEQ ID NO.5/SSR185R：SEQ ID NO.6）和Me3Em15（Me3：SEQ ID NO.7/Em15：SEQ ID NO.8）；一级分枝长度关联分子标记为SSR341（SSR341F：SEQ ID NO.9/SSR341R：SEQ ID NO.10）、Me4Em3（Me4：SEQ ID NO.11/Em3：SEQ ID NO.12）、Me3Em8（Me3：SEQ ID NO.7/Em8：SEQ ID NO.13）、Me20Em4（Me20：SEQ ID NO.14/Em4：SEQ ID NO.15）和Me21Em5（Me21：SEQ ID NO.16/Em5：SEQ ID NO.17）。