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08第八章病毒病的实验室诊断.pptx

花匠小妙招
2025-07-09 19:08

第八章：病毒病的实验室诊断 ;第一节病毒病的常规实验诊断;1、病料采集后的保存;（1）脑、肝、肌肉等器官或组织充分研磨后加入5倍量的Hank’s液（内含青霉素、链霉素各200U/ml），反复冻融3次。2000r/min离心 10min，取上清作接种物。（2）鼻液、乳汁、脓汁等分泌物或渗出物用1000u/ml含青、链霉素（P.S）的Hank’s液，将其稀释3-5倍，充分混匀悬浮后，置4℃冰箱内感作2-4h或过夜，2000r/min 10min，取上清作接种物。 ;（3）、咽喉拭子或鼻拭子仔细用棉拭子擦拭咽喉部或鼻部，并迅速将其泡入盛有2-5ml Hank’s液（200-500u/ml P.S）的试管内，充分涮洗棉拭子，反复冻融3-5次，收集液体部分，2000r/min 10min，收集上清作接种物。（4）粪便用棉拭子插入肛门沾取或扑杀病畜后由肠管采集。用含1000u/ml P.S的Hank’s液作10-20倍稀释，4℃感作4h，2000r/min 10min取上清作接种物。（5）无菌的体液或鸡胚液直接用于接种;3 接种方法;4 组织培养细胞中病毒增殖的判定;RSV;2、细胞代谢的测定活细胞在代谢过程中产生各种酸类，使营养液的pH下降，而病毒感染的细胞由于代谢障碍，产酸能力降低，且因细胞破坏，释出碱性成分，营养液的pH下降不明显，甚至上升。腺病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒 ;3、抗原的测定 Viral proteins: hemagglutination (influenza virus), immunofluorescence, SDS, western blot;4、中和试验;5、病毒间的干扰现象乙型脑炎病毒 ——脊髓灰质炎病毒流感病毒 —— 西方马脑炎病毒猪传染性胃肠炎病毒 —— 牛病毒性腹泻-粘膜病病毒 ;6、电子显微镜观察;5 病毒感染力的滴定;蚀斑技术;Procedures;6 病毒理化学特性的测定;（2）脂溶剂敏感性试验乙醚敏感试验取同批病毒分装于两个青霉素瓶中，每瓶16ml，在其中1瓶加入麻醉用乙醚，使终浓度为20%，两瓶均用橡皮塞塞紧后，置4℃冻箱内作用24h，其间不时振荡，随后以2000rpm离心20min。已加乙醚的小瓶，此时分为清晰的两层，上层为乙醚，下层为病毒液，用毛细吸管吸取病毒液，移入另一小瓶内，适当吹打，使残余乙醚挥发殆尽，然后滴定两组病毒的TCID50。;氯仿敏感性试验向病毒液内加入分析纯氯仿，使其终浓度为4.8%，置4℃振荡混合10min。随后500rpm 5min，然后吸取上层液体，滴定病毒 TCID50。对照组病毒加入终浓度为4.8%的生理盐水，同样处理和滴定。然后测定两组病毒的TCID50。 ;胰蛋白酶敏感试验脊髓灰质炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒对胰酶有较强的抵抗力痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活取病毒液两瓶，每瓶1ml，在其中1瓶加入1ml 1%的胰蛋白酶，使终浓度为0.5%，另一瓶加入1ml 培养液，用橡皮塞塞紧瓶口，将小瓶倒转几次，使其充分混合，置37℃ 1h，随即加入灭活犊牛血清8ml，充分混合，终止胰酶的作用。最后滴定两瓶病毒的TCID50。 ;（4）、耐酸性试验取等量病毒液两瓶，用0.1mol/L HCl将1个小瓶中的病毒液的pH调至3.0(or 5.0)，并在另一个小瓶内加入相同于用酸量的培养液作为对照，置37℃水溶或室温中感作2h(or 1h)，再用5.6% NaHCO3溶液将pH调回至7.2左右，对照组再加入相同于NaHCO3量的培养液。测定两者的TCID50。 ;6、病毒粒子大小测定 (1)? 电子显微镜直接观察磷钨酸负染后，透射电镜观察 (2)? 超速离心沉淀 (3)? 滤过试验; 病毒液种类 TCID50/0.1ml 滤前病毒液 10-6.75 450nm孔径液 10-6.23 225nm孔径液 10-5.78 100nm孔径液 10-4.50 50nm孔径液 10-0.50; 检测发病动物体液中的抗体（Ab），或进一步比较动物急性发病期和恢复期血清中的Ab效价，了解病毒性Ab是否有明显的增长，从而判定病毒感染的存在。新分离毒株的种类及型别的鉴定。;1、微量中和试验固定病毒-稀释血清法中和试验固定血清-稀释病毒法中和试验;2、蚀（噬）斑减数试验; 3、交叉保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后