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响应面法优化盐关黄柏炮制工艺及其成分与色度相关性分析

花匠小妙招
2025-07-23 21:04

关黄柏为东北地区大宗中药材，来源于芸香科黄檗属植物黄檗Phellodendron amurenseRupr.，入药部位为干燥树皮，清热燥湿、泻火除蒸为其主要功效。

现代研究显示，关黄柏主要含有生物碱类、酚酸类、内酯类及苯丙素类化合物[1-3]。黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱等生物碱类成分及柠檬苦素为关黄柏的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等生物活性[4-9]，其中黄柏碱还能纠正糖脂代谢紊乱，起到降血糖的作用[10]，具有一定的开发应用价值。《中国药典》2020年版收载的黄柏包括川黄柏和关黄柏，川黄柏应用历史较久，《本草纲目》记载：“黄檗性寒而沉，生用则降实火，熟用则不伤胃，酒制则治上，盐制则治下，蜜制则治中[11]”，关黄柏起源较晚，在历代本草中无记载，首载于《朝鲜药局方》，功能主治同川黄柏[12]，经查阅文献，关黄柏常以生品、清炒品、酒制品、盐制品及蜜制品入药。

随着时代的发展和临床研究的更迭，目前关黄柏常用炮制方法主要有切制、炒制、盐制等[13]。切制、炒制工艺相对简单，其质量评价和工艺优选研究较多，而有关盐关黄柏研究相对较少，见有研究者选择黄柏碱、盐酸小檗碱为指标，以正交试验优化盐关黄柏炮制工艺[14-17]。且《中国药典》2020年版规定：“盐关黄柏形如关黄柏丝，深黄色，偶有焦斑，略具咸味[18]”，仅规定盐关黄柏性状指标，工艺参数尚不明确，无法保证产品质量的均一稳定。

本实验以关黄柏多个有效成分为评价指标，通过熵权法结合Box-Behnken设计-响应面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）优化盐关黄柏炮制工艺，并借助色差分析技术，对盐关黄柏样品的色泽指标进行量化，研究外观色泽与其化学成分的相关性，从多维度筛选盐关黄柏的炮制工艺参数，为盐关黄柏质量控制提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1仪器

LC-2030型高效液相色谱仪、AUW120D型分析天平，岛津企业管理中国有限公司；NH310型色差仪，深圳市三恩驰科技有限公司；MS-5型炒货机，迈斯机械有限公司。

1.2药品与试剂

关黄柏，批号20220215，购自吉林省北药中药制药集团有限公司，由长春中医药大学翁丽丽教授鉴定，为芸香科黄檗属植物黄檗P.amurense Rupr.的干燥树皮，按《中国药典》2020年版规定方法进行检测，均符合规定；对照品黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素批号分别为B20552、B20882、B21476、B21433、B21449、B20911，质量分数均≥98%，均购自于上海源叶生物科技有限公司；食用盐，批号STHY0002，购自福建省泉州晶海轻化有限公司。

1.3盐关黄柏的制备

取“1.2”项下的关黄柏药材，依照2020年版全国中药饮片炮制规范及《中国药典》2020年版方法进行炮制[18-19]，具体为“加盐水（每100 kg药材加2 kg盐）拌匀，闷至盐水被吸尽，置预热的炒制设备内，文火炒干，取出，放凉”。

2 方法与结果

2.1盐关黄柏有效成分含量测定

2.1.1供试品溶液的制备参考文献方法[20]，取盐关黄柏粉末约0.2 g（过三号筛），精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，甲醇补足减失的质量，精密吸取续滤液25 mL，蒸干，溶解、定容于10 mL量瓶中，混匀，过0.22 μm滤膜，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.2混合对照品溶液的制备取“1.2”项下6种对照品适量，精密称定，加甲醇制成分别含黄柏碱28.38 μg/mL、木兰花碱64.12 μg/mL、药根碱50.08 μg/mL、盐酸巴马汀56.25 μg/mL、盐酸小檗碱82.45 μg/mL、柠檬苦素74.58 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

2.1.3色谱条件色谱柱为Hypers11 BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脱：0～5 min，10%乙腈；5～20 min，10%～17%乙腈；20～40 min，17%～25%乙腈；40～65 min，25%～35%乙腈；65～70 min，35%～45%乙腈；70～80 min，45%～10%乙腈；柱温25℃；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为208 nm；进样量10 μL。盐关黄柏样品及混合对照品的HPLC图见图1。

2.1.4线性关系考察精密称取“1.2”项下6种对照品适量，置于同一量瓶中，加甲醇溶解制成质量浓度分别为302.0、80.1、4.9、61.3、20.3、20.2 μg/mL的混合对照品溶液，分别吸取2.0、1.8、1.4、1.0、0.6、0.2 mL置于2 mL量瓶中，甲醇定容，制成系列线性溶液，高效液相色谱仪检测，进样量为10 μL，以峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程分别为黄柏碱Y＝99 136 187.764 4 X＋33 715.221 5，r＝0.999 5，线性范围30.2～302.0 μg/mL；木兰花碱Y＝36 865 848.169 2 X＋9 257.411 0，r＝0.999 8，线性范围80.1～801.0 μg/mL；药根碱Y＝3 762 708.038 7 X－340.636 0，r＝0.999 6，线性范围49.0～492.0 μg/mL；盐酸巴马汀Y＝23 264 259.760 0 X＋29 080.178 1，r＝0.999 5，线性范围61.0～613.0 μg/mL；盐酸小檗碱Y＝26 391 298.532 9 X＋13 612.383 6，r＝0.999 7，线性范围203.0～2 028.0 μg/mL；柠檬苦素Y＝7 302 355.621 2 X＋19 200.356 2，r＝0.999 5，线性范围200.0～2 020.0 μg/mL。

2.1.5精密度试验精密吸取混合对照品溶液10 μL，注入液相色谱仪，连续进样6次，依法测定，记录峰面积积分值，结果黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素的RSD分别为0.52%、0.42%、0.39%、0.36%、0.71%、0.52%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，在0、2、4、6、8、10、12、24 h分别注入液相色谱仪，依法测定，以“1.2”项下6种对照品峰面积积分值为指标，记录峰面积积分值，结果黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素的RSD分别为1.10%、1.30%、1.88%、0.98%、1.25%、1.88%，表明供试品溶液在24 h内具有良好的稳定性。

2.1.7 重复性试验精密称取同一批供试品（批号20220215）6份，按“2.1.1”项下方法制备，依法独立测定，计算样品质量分数，结果黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素质量分数的RSD分别为0.89%、1.38%、1.86%、0.53%、1.30%、1.05%，结果表明本法具有良好的重复性。

2.1.8 加样回收率试验取盐关黄柏粉末（过三号筛）约0.1 g，6份，精密称定，分别加入混合对照品2 mL（含黄柏碱26.6 μg/mL，木兰花碱79.8 μg/mL，药根碱47.0 μg/mL，盐酸巴马汀58.2 μg/mL，盐酸小檗碱131.8 μg/mL，柠檬苦素88.5 μg/mL），按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，依“2.1.3”项下方法测定，计算加样回收率。结果显示黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素的平均加样回收率分别为97.52%、102.35%、98.13%、97.89%、97.45%、102.35%，RSD分别为0.56%、0.60%、0.45%、0.93%、0.48%、0.42%，表明结果准确性良好，方法可行。

2.2综合评价指标的确定

熵权法是在综合考虑各因素，根据各项指标测量值所提供的信息量大小确定指标权重的方法[21]。按公式dij＝(fij－min fij)/(max fij－min fij)，进行数据标准化，再计算信息熵（Ej），fij为第i次实验时第j个指标的测定值。第j项指标Ej公式为

最后计算各指标客观权重（Wj）。各项指标所占的Wj：黄柏碱W1（0.204 6），木兰花碱W2（0.164 5），药根碱W3（0.129 9），盐酸巴马汀W4（0.180 3），盐酸小檗碱W5（0.170 5），柠檬苦素W6（0.150 2）。

2.3单因素试验

以“药透汤尽”作为闷润时间的判断标准，闷润25 min。按照《中国药典》2020年版要求[18]，每100 kg药材用食盐2 kg，以盐水量、炒制温度、炒制时间为影响因素，进行单因素考察。

2.3.1盐水量的选择取200 g关黄柏饮片5份，分别加入13.33%盐水30 mL、10.00%盐水40 mL、8.00%盐水50 mL、6.67%盐水60 mL、5.71%盐水70 mL，闷润25 min，150 ℃下炒30 min取出。运用熵权法计算综合评分，结果见表1，选择盐水量为50、60、70 mL进行后续研究。

2.3.2炒制温度的选择取200 g关黄柏饮片5份，加入浓度为6.67%盐水60 mL，闷润25 min，分别在120、130、140、150、160 ℃下炒30 min，取出。运用熵权法计算综合评分，结果见表2，选择炒制温度为130、140、150 ℃进行后续研究。

2.3.3炒制时间的选择取200 g关黄柏饮片5份，加入6.67%盐水60 mL，闷润25 min，140 ℃下分别炒15、20、25、30、35 min取出。运用熵权法计算综合评分，结果见表3，选择炒制时间为25、30、35 min进行后续研究。

2.4 BBD-RSM优化关黄柏盐制工艺

2.4.1BBD-RSM实验设计及结果在单因素试验的基础上，应用Design-Expert 12.0软件设计BBD-RSM炮制工艺实验方案。以盐水量（X1）、炒制温度（X2）和炒制时间（X3）为因素，建立3因素3水平试验方案。取同一批次关黄柏饮片17份，每份200 g，具体因素与水平设计见表4，按“2.1.1”项下方法制备盐关黄柏供试品溶液，按“2.1.3”项下条件，测定样品中黄柏碱（Y1）、木兰花碱（Y2）、药根碱（Y3）、盐酸巴马汀（Y4）、盐酸小檗碱（Y5）、柠檬苦素（Y6）的含量，以6种化学成分含量的综合评分（S）作为评价指标，具体实验结果见表4。

S＝Y1/Y1max×W1＋Y2/Y2max×W2＋Y3/Y3max×W3＋Y4/ Y4max×W4＋Y5/Y5max×W5＋Y6/Y6max×W6

2.4.2 模型拟合采用Design-Expert 12.0软件对表4中的BBD-RSM实验结果进行多元二次回归，以盐水量（X1）、炒制温度（X2）和炒制时间（X3）为自变量，以S为响应值，得到回归方程为S＝95.34－0.44X1＋0.8X2＋0.60X3＋0.83X1X2＋1.91X1X3－2.20X2X3－7.04X12－5.31X22－6.77X32。对模型进行方差分析，结果如表5所示，模型P值为0.000 3＜0.01，说明拟合的模型具有统计学意义；失拟项P值为0.790 0＞0.05，即失拟度没有显著性差异，说明实验数据受到未知因素的影响相对较小，可应用此模型来开展预测与研究；相关系数R2＝0.964 7，表明方程拟合程度较好，实验误差小，预测Rpre2＝0.919 3与调整Radj2＝0.837 9基本一致，说明该模型可以预测盐关黄柏的炮制工艺；差异系数（CV）＝2.10%，说明本研究的可信度和准确度高。各因素对综合评分影响程度从大到小依次为X2＞X3＞X1。

进一步通过Design-Expert 12.0软件获得二次回归方程响应面图与等高线，进而确认相关因素的交互强度，合理确认最优的工艺参数。等高线的形状可判断其中的交互效应，当其形状接近椭圆时意味着交互效应显著，当其形状接近圆形时意味着交互效应相对偏弱，具体见图2。根据Design-Expert 12.0软件拟合的盐关黄柏最优炮制工艺条件，并且与实际操作情况相结合，即得每200克关黄柏饮片加入6.67%盐水60 mL、炒制温度为140 ℃、炒制时间为30 min的最优炮制工艺参数。

2.4.3验证实验按“2.1.1”项下方法制备3份最佳工艺参数供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件分析测定，进行验证试验，结果见表6，3次验证实验的平均综合评分为96.943 8，RSD＝0.44%（n＝3），与模型预测值相近，表明模型预测性较好。

2.5盐关黄柏色度试验

2.5.1 测定条件设定参数为D65、LED蓝光激发光源，8°视角视场，8 mm孔径，仪器误差ΔEab*≤0.4。校正后进行测定，样品外观色泽信息如表4所示，样品饮片及粉末图见图3。

2.5.2供试品的制备取过3号筛的盐关黄柏样品粉末约3 g，填满测色盒，待测。

2.5.3精密度考察分别依照“2.5.2”和“2.5.1”项下的方法制备1份供试品，连续测定6次，导出色泽指标L*、a*、b*值，结果RSD均小于2%，表明仪器精密度较好。

2.5.4重复性考察分别依照“2.5.2”和“2.5.1”项下的方法制备6份供试品，测定色度，导出色泽指标L*、a*、b*值，结果RSD均小于2%，表明方法重现性良好。

2.5.5稳定性考察分别依照“2.5.2”和“2.5.1”项下的方法制备1份供试品，分别于0、1、2、3、4、5、6 h测定色度，导出色泽指标L*、a*、b*值，结果RSD均小于2%，表明盐关黄柏样品在6 h内呈现稳定状态。

2.5.6样品色度测定分别依照“2.5.2”和“2.5.1”项下的方法制备17份供试品，每份重复测定色度3次，以平均值为各样品测定结果，导出色泽指标L*、a*、b*值，结果见表7，盐关黄柏有效成分含量变化及盐关黄柏色度变化趋势图如图4所示，色度热图如图5所示。

2.5.7相关性分析将盐关黄柏中6种有效成分黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素含量与色泽指标L*、a*、b*值相关联，用SPSS 26.0软件做相关性分析，结果见表8。由此可知，盐关黄柏中黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素含量与L*值呈负相关，与a*、b*值均呈正相关，说明在一定程度上L*值越小，a*、b*值越大，颜色越接近深棕黄色，盐关黄柏中黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素含量越高。其中黄柏碱与L*、a*、b*均呈极显著相关；木兰花碱与L*、b*呈显著相关，与a*呈极显著相关；药根碱与L*、a*、b*均呈显著相关；盐酸巴马汀与L*、a*、b*均呈极显著相关；盐酸小檗碱与L*、a*、b*均呈极显著相关；柠檬苦素与L*、a*均呈显著相关，与b*呈极显著相关。

2.5.8回归分析利用SPSS 26.0软件，以盐关黄柏有效成分黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素质量分数为因变量，以色泽指标L*、a*、b*值为自变量进行回归分析，结果见表9～11。

由表9可知，黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素的质量分数与L*、a*、b*模型的r2分别为0.642、0.503、0.370、0.671、0.525、0.553，说明上述成分均受色泽指标L*、a*、b*影响。其中黄柏碱、盐酸巴马汀、柠檬苦素质量分数受色度影响较大，表现为L*值越小，a*、b*值越大，其质量分数越高。

由表10可知，3个色泽指标值与黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素的含量构成的回归方差呈显著性；与药根碱含量构成的回归方差无显著性，表明黄柏碱、木兰花碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素在盐关黄柏中含量较高，可能与色泽存在相关性。

由表11可得回归方程Y黄柏碱含量＝1.232－0.001 L*＋0.052 a*＋0.035 b*；Y木兰花碱含量＝6.741－0.014 L*＋0.217 a*＋0.057 b*；Y药根碱含量＝0.124＋0.005 L*＋0.018 a*＋0.011 b*；Y盐酸巴马汀含量＝2.808＋0.010 L*＋0.113 a*＋0.052 b*；Y盐酸小檗碱含量＝6.975＋0.081 L*＋0.278 a*＋0.104 b*；Y柠檬苦素含量＝−2.513＋0.170 L*－0.148 a*＋0.131 b*，可通过盐关黄柏的色泽指标值初步评价盐关黄柏品质。

2.5.9 验证实验分别依照“2.5.2”和“2.5.1”项下的方法制备3份供试品（最优工艺参数），按“2.5.6”项下方法测定，进行验证实验，结果见表12，所得盐关黄柏饮片的L*、a*、b*、Eab*值分别为59.33～60.15、9.45～9.70、28.01～28.76、66.42～67.06。

3 讨论

3.1盐关黄柏炮制工艺的优选

为进一步规范盐关黄柏炮制工艺，提高中药质量，本研究采用熵权法结合响应面法，以黄柏碱等成分为指标，以盐水量、炒制温度、炒制时间为影响因素进行工艺优化，得到最佳炮制工艺为每200 g关黄柏饮片加6.67%盐水60 mL，闷润25 min，140 ℃炒制30 min。优选后盐关黄柏炮制工艺参数明确，能在一定程度上保障有效成分的含量，进而确保盐关黄柏的品质。

关黄柏药材主要有效成分为黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱及柠檬苦素等。有研究表明，盐制会增加关黄柏中有效成分的溶出，增强药效和生物利用度[22-23]。通过响应面实验结果可知，炮制后关黄柏有效成分均有所增加，特别是S13至S17样品（最优工艺参数），上述指标性成分含量增加明显，这可能与盐制后水溶性成分溶出度增加有关。其中综合评分最低的为S6样品，其有效成分含量增加不明显，可能是炒制时间不足，反应不充分或盐水浓度过低，水分过多造成关黄柏中的生物碱流失，这与文献所载相一致[24]。

3.2盐关黄柏内在成分与外观色泽相关性分析

利用色差仪对物质进行色泽分析，能减少人为因素导致的误差，得到精准的色度量化值[25-27]。有研究显示，中药材经炮制后，在化学成分改变的同时往往伴随着色泽变化[28-31]。为确保盐关黄柏炮制的最佳工艺参数明确，将盐关黄柏样品有效成分含量与色度相关联，探讨盐关黄柏内在成分与外观色泽的关联性。Pearson相关性分析结果发现，盐关黄柏的成分与L*、a*、b*值密切相关，且均与L*存在负相关，与a*、b*存在正相关，L*值越小，a*、b*值越大，颜色越接近深棕黄色，黄柏碱、木兰花碱、药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、柠檬苦素含量越高，表明盐关黄柏在不同盐水量、炒制温度、炒制时间的炮制参数下，黄柏碱等成分的含量与色度均有一定程度的变化且有明显相关性。在此基础上进行回归分析，找到一种可以初步评价盐关黄柏品质的方法。

本研究在“辨状论质”的思想指导下，将外观色泽表征量化，并与盐关黄柏饮片内在成分含量相结合，使得基于色泽鉴别盐关黄柏饮片的方法更加客观，盐关黄柏炮制工艺参数更加明确，为盐关黄柏炮制过程的质量控制提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：杨静容，陈亚楠，肖春萍，侯晓琳，翁丽丽，姜雨昕．响应面法优化盐关黄柏炮制工艺及其成分与色度相关性分析 [J]. 中草药, 2024, 55(15): 5093-5103.