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一种多花黄精新品种再生与体外成苗的方法

花匠小妙招
2025-07-28 00:46

1.本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种多花黄精新品种再生与体外成苗的方法。

背景技术：

2.多花黄精(polygonatum cyrtonema)为百合科黄精属多年生草本药用植物，其根茎含有丰富的糖类、甾体皂苷、强心苷、生物碱和黄酮等多种药用化合物，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效。近年来，随着人们生活水平的提高和市场对多花黄精的需求的增加，使得黄精的产业化栽培发展面临着前所未有的机遇。由于野生黄精资源被过度采挖，并逐渐枯竭，而市场上多花黄精的用量逐渐加大，迫使大面积人工栽培以补充资源的不足，这就造成近期市场上多花黄精种苗供应短缺的现象。同时，由于一个良种可以带动一个产业，多花黄精种苗质量的优劣、余缺，不仅直接影响黄精的品质和产量，也关系到中药产业的健康可持续发展和人们的生命安全。因此，在多花黄精种质资源选育的基础上，研究多花黄精优良品种的高效、短周期、低成本快繁技术对多花黄精产业的可持续发展具有重要意义。
3.祁源黄精作为选育的多花黄精新品种(审定编号：皖品鉴登字第1806007)与常规种植的多花黄精相比具有较大的营养器官和较高的有效成分含量，具有更高的药用价值和市场需求。目前，祁源黄精主要采用种子和根茎为原始材料进行繁殖，通过播种方式进行繁殖存在种子萌发周期长，萌发率低，繁殖受季节和时节限制且很难保持母本株系的遗传稳定性等问题；而利用块茎进行繁殖虽然能保持母本株系的优良农艺性状，但却存在繁殖材料有限和繁殖系数低的问题，很难满足祁源黄精的产业化种植和推广应用需求。植物组织培养技术作为现代生物技术具有繁殖效率高，繁殖周期短，繁殖不受季节和时间限制等优势，在植物种苗规模化繁育中起着重要作用。目前有关利用植物组织培养技术对多花黄精进行繁育的研究已有报道，如公开号为cn 109302983 a的专利公开一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法，但存在繁殖周期长，成本高，重复性差的问题，且并不适用于多花黄精新品种——祁源黄精的快速繁殖。

技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于提供一种适用于多花黄精新品种高效再生和体外成苗的方法，且成苗时间短，繁殖系数、不定芽诱导率、不定根诱导率高。
5.本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
6.一种多花黄精新品种再生与体外成苗的方法，所述多花黄精新品种为祁源黄精，所述方法包括以下步骤：以所述祁源黄精块茎萌发幼苗的幼嫩叶片为外植体，经表面消毒后，剪切成适宜大小的切块后，经不定芽诱导、不定芽增殖和伸长、瓶外不定根诱导处理、定植及成苗管理步骤最终获得祁源黄精完整再生植株；
7.所述幼嫩叶片的叶龄为13-17d；
8.所述不定芽诱导采用的培养基为含有0.5-2.0mg/l tdz、0.5-2.5mg/lagno3、
3.0％(w/v)蔗糖和琼脂的dkw培养基；
9.所述不定芽增殖和伸长采用的培养基为含有0.05-1.0mg/l tdz、0.05-0.25mg/l iaa、0.5-2.5mg/l ga3、3.0％(w/v)蔗糖和琼脂的dkw培养基；
10.所述瓶外不定根诱导处理采用的培养基为含有500-1000mg/l k-iba、100-500mm褪黑素和200-500mg/l naa的生根促进液。
11.有益效果：采用本发明中的方法适用于祁源黄精，取材少，取材方便且材料丰富；繁殖效率高，不定芽诱导率高达93.4％，不定根诱导率高达97.4％。成苗时间短，11周即可成苗，繁殖系数高，为祁源黄精植株的快速繁殖和后期优良株系的规模化生产提供了技术支撑。
12.tdz与agno3结合并添加于dkw培养基能够提高不定芽的诱导效果，低浓度tdz结合低浓度iaa和ga3在增加不定芽个数的同时提高不定芽的长度。
13.通过本发明的研究，不同年龄叶片的再生能力存在差异，而本发明中叶龄为13-17d，不定芽诱导率能够达到最高。
14.优选地，所述不定芽诱导采用的培养基为含有0.5mg/l tdz和2.0mg/l agno3的dkw培养基，所述不定芽增殖和伸长采用的培养基为含有0.2mg/l tdz、0.05mg/l iaa和1.0mg/l ga3的dkw培养基。
15.有益效果：当采用上述培养基时，能够进一步提高不定芽的诱导效率、不定芽增殖和诱导效果。
16.优选地，所述表面消毒包括以下步骤：将外植体放置于容器中密闭后，于自来水下冲洗、置于无菌操作台中，用无菌水冲洗，然后用无水乙醇消毒，再用无菌水冲洗，然后用0.1％(v/v)hgcl2溶液消毒2-3min，再用无菌水冲洗遍，最后用无菌滤纸吸干种子表面水分后备用。
17.有益效果：不同种类消毒剂及消毒时间对祁源黄精叶片污染率和不定芽的诱导率具有重要影响。本发明采用以0.1％hgcl2的消毒的消毒效果及不定芽的诱导情况优于过氧化氢和次氯酸钠，不定芽诱导率最高达到93.4％。
18.优选地，所述剪切成适宜大小的切块是指将叶片去除叶尖后剪切成0.25-1.0cm2大小，备用。
19.优选地，所述不定芽增殖和伸长指将光照培养4周后的伸长的祁源黄精不定芽接种于不定芽增殖和伸长采用的培养基。
20.优选地，所述瓶外不定根诱导处理是指将光照培养4周后的伸长的黄精不定芽从不定芽丛上分离下来，经流水冲洗后，吸干表面水分后，将伸长芽的形态学下端浸于瓶外不定根诱导处理采用的培养基中进行不定根诱导处理，所述诱导处理的时间为30-120s。
21.优选地，所述定植是将经不定根诱导处理后的祁源黄精组培伸长芽的形态学下端定植于装有营养基质的营养基质盘中进行不定根的诱导；所述的营养基质包括营养土、珍珠岩和蛭石，其中营养土、珍珠岩与蛭石的的质量比为2:1:1。
22.优选地，所述成苗管理是将定植后的祁源黄精组培伸长芽喷施一次营养液，盖上盖子，置于温度为20-23℃、相对湿度为85-90％的温室中进行成苗培养，每隔5-7d浇1次水，1个月后去除塑料盖。
23.优选地，所述营养液的成分为用双蒸水配制的30％-50％的霍格兰氏营养液。
24.本发明的优点在于：采用本发明中的方法适用于祁源黄精，取材少，取材方便且材料丰富；繁殖效率高，不定芽诱导率高达93.4％，不定根诱导率高达97.4％。成苗时间短，11周即可成苗，繁殖系数高，为祁源黄精植株的快速繁殖和后期优良株系的规模化生产提供了技术支撑。
25.tdz与agno3结合并添加于dkw培养基能够提高不定芽的诱导效果，低浓度tdz结合低浓度iaa和ga3在增加不定芽个数的同时提高不定芽的长度。
26.通过本发明的研究，不同年龄叶片的再生能力存在差异，而本发明中叶龄为13-17d，不定芽诱导率能够达到最高。
27.当采用特定培养基时，能够进一步提高不定芽的诱导效率、不定芽增殖和诱导效果。
28.不同种类消毒剂及消毒时间对祁源黄精叶片污染率和不定芽的诱导率具有重要影响。本发明采用以0.1％hgcl2的消毒的消毒效果及不定芽的诱导情况优于过氧化氢和次氯酸钠，不定芽诱导率最高达到93.4％。
29.采用本发明中的方法，不定芽诱导率高达93.4％，平均每个外植体产生9.4个不定芽，增殖与伸长培养后平均每个外植体产生30.1个长度为2.8cm的不定芽；不定根诱导率高达97.4％，平均每个外植体产生4.3条不定根。
附图说明
30.图1为本发明实施例1中的祁源黄精块茎萌发幼苗图；
31.图2为本发明实施例1中的接种于不定芽诱导培养基上4d的叶片切块图；
32.图3为本发明实施例1中的祁源黄精叶片不定芽诱导图；图中a、b均为不定芽再生(非愈伤组织)；
33.图4为本发明实施例1中的祁源黄精不定芽增殖与伸长图；
34.图5为本发明实施例1中的祁源黄精组培伸长芽生根定植图；
35.图6为本发明实施例1中的祁源黄精体外生根成苗图；
36.图7为本发明实施例1中的祁源黄精完整再生植株图。
具体实施方式
37.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
38.下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
39.实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
40.实施例1
41.一种多花黄精新品种再生与体外成苗的方法，具体包括以下步骤：
42.(1)以生长在温室中的多花黄精新品种——祁源黄精1年生块茎萌发的幼苗(图1)为外植体来源，选取叶龄为15d的叶片做外植体。
43.(2)将步骤(1)中的叶片放置于250ml三角瓶中纱布封口，于自来水下冲洗20min后置于无菌操作台中，用无菌水冲洗4遍；然后用75％无水乙醇消毒45s，再用无菌水冲洗6遍；然后用0.1％(v/v)氯化汞溶液消毒3min，再用无菌水冲洗6遍。最后用无菌滤纸吸干种子表面水分后备用。
44.(3)将步骤(2)中消毒后的叶片去除叶尖后剪切成0.25-1.0cm2大小，接种于含有不定芽诱导培养的玻璃培养皿中进行不定芽的诱导培养(图2)，其中不定芽的诱导培养基为：dkw+0.5mg/l tdz+2.0mg/l agno3+3.0％(w/v)蔗糖+0.7％(w/v)琼脂。光照培养2周后，叶片切口处有膨大突起形成；光照培养4周后，叶片切块处形成不定芽(图3)，不定芽诱导率为93.4％，平均每个外植体产生9.4个不定芽。
45.(4)将步骤(3)中诱导出不定芽的叶片切块转接于不定芽增殖培养基中进行不定芽的增殖和伸长培养，其中不定芽增殖培养基为：dkw+0.2mg/l tdz+0.05mg/l iaa+1.0mg/l ga3+3.0％(w/v)蔗糖+0.7％(w/v)琼脂。光照培养4周后，平均每个外植体产生30.1个不定芽，增殖系数为3.2；平均芽长2.8cm(图4)。
46.(5)将步骤(4)中伸长的多花黄精不定芽从不定芽丛上分离下来，经流水冲洗后，吸干表面水分后，将伸长芽的形态学下端浸于添加有750mg/l k-iba、500mg/l褪黑素和200mg/l iba的生根促进液中进行不定根诱导处理，处理的时间为60s；
47.(6)将不定根诱导处理后的祁源黄精组培伸长芽的形态学下端定植于装有营养基质的营养基质盘中(图5)，所述的营养基质包括营养土、珍珠岩和蛭石，其中营养土、珍珠岩与蛭石的的质量比为2:1:1。
48.(7)将定植后的祁源黄精组培伸长芽喷施一次自来水配制的40％的霍格兰氏的营养液，盖上盖子，置于温度为20-23℃、相对湿度为85-90％的温室中进行成苗培养，每隔5-7d浇1次水，1个月后去除塑料盖。光照培养3周后，不定根诱导率高达97.4％，平均每个外植体产生4.3条不定根(图6)。
49.实施例2
50.不同消毒方法对祁源黄精叶片离体再生的影响
51.以多花黄精新品种块茎萌发幼苗的苗龄为15d的幼嫩叶片为外植体，将叶片按照实施例1中放置于三角瓶中用纱布封口，于自来水下冲洗20min后置于无菌操作台中，用无菌水冲洗4遍；然后用75％无水乙醇消毒45s，再用无菌水冲洗6遍；然后用10％h2o2溶液，0.1％(v/v)hgcl2溶液和20％naclo溶液分别消毒2-10min，再用无菌水冲洗6遍。最后用无菌滤纸吸干叶片表面水分，接种于实施例1中所涉及的不定芽诱导基中进行不定芽诱导培养。光照培养1个月后，统计叶片污染率及不定芽诱导率。
52.结果如表1所示。研究结果表明不同种类消毒剂及消毒时间对祁源黄精叶片污染率和不定芽的诱导率具有重要影响。在所测试的消毒剂种类和消毒时间中，以0.1％hgcl2的消毒3min的消毒效果及不定芽的诱导情况最佳，污染率仅为2.3％，不定芽诱导率高达93.4％。随着消毒时间的延长，污染率进一步降低，但叶片也出现逐步坏死的现象，不定芽诱导率也逐渐降低。因此，在后续的研究中，采用0.1％hgcl2作为消毒剂。
53.表1不同消毒剂种类及消毒时间对祁源黄精叶片污染和不定芽诱导的影响
[0054][0055]
实施例3
[0056]
叶片叶龄对祁源黄精不定芽诱导率的影响
[0057]
选取不同叶龄(5，10，15，30，45和60d)的叶片作为外植体，采用实施例1中方法消毒后接种于实施例1中的不定芽诱导培养基中进行不定芽的诱导。光照培养4周后测量不定芽的诱导率及平均每个外植体所产生的不定芽个数。研究结果如表2所示。
[0058]
研究结果表明叶龄大小对叶片不定芽的诱导具有一定的影响，随着叶龄的增加，叶片不定芽再生能力呈现先增后降的趋势。在所测试的不同叶龄的叶片中，以叶龄为15d的叶片再生能力最强，不定芽诱导率高达93.4％，平均每个外植体产生9.4个不定芽，随着叶龄的增加，不定芽诱导率及不定芽个数逐渐降低，60d叶龄的不定芽诱导率仅为11.2％，平均每个外植体仅产生1.3个不定芽。我们推测不同叶龄的叶片再生能力的差异部分原因可能是由于不同叶龄的叶片，由于生理状态不同，其内部次生代谢物含量、植物激素的产生或运输或对植物激素的反应均会有所差异，从而导致再生能力存在差异。
[0059]
表2叶龄对祁源黄精叶片不定芽诱导的影响
[0060]
叶龄(d)不定芽诱导率(％)不定芽数/外植体
537.83.61062.55.11593.49.43032.62.76011.21.3
[0061]
实施例4
[0062]
不同种类和浓度植物生长调节剂及培养基类型对祁源黄精叶片不定芽诱导的影响
[0063]
按照实施例1中的实施方法，以叶龄为15d的叶片为外植体，消毒后接种于添加有不同种类和浓度植物生长调节物质的不同类型基本培养基中于恒温培养室进行不定芽的诱导培养。具体如表3所示。
[0064]
研究结果表明植物生长调节物质的种类、浓度及培养基类型在祁源黄精不定芽的诱导过程中起着至关重要的作用。其中在同等浓度下，tdz的不定芽诱导效果要好于6-ba的诱导效果，且进一步研究发现，tdz与agno3的结合使用能进一步提高不定芽的诱导效率及不定芽个数。在测试的3种培养及类型中，以dkw为基本培养基的诱导效果最好。因此，祁源黄精叶片不定芽的最佳诱导培养基为添加有0.5mg/l tdz和2.0mg/lagno3的dkw培养基。
[0065]
表3培养基类型及植物生长调节物质对祁源黄精叶片不定芽诱导的影响
[0066][0067]
实施例5
[0068]
为进一步提高祁源黄精叶片不定芽的增殖效率和高度，测试了tdz、iaa与ga3浓度对不定芽增殖和伸长的影响。
[0069]
将实施例1中获得的不定芽丛转接于添加有不同浓度tdz、iaa及ga3的培养基中，于实施例1相同的条件下进行不定芽的增殖和伸长培养。
[0070]
研究结果表明培养基中3种植物生长调节剂的浓度对不定芽增殖和伸长具有重要影响，低浓度tdz的使用利于不定芽的增殖，同时培养基中ga3的使用能够促进不定芽伸长，且培养基中低浓度iaa的添加能够提高不定芽的个数。低浓度tdz结合低浓度iaa和ga3在增加不定芽个数的同时提高不定芽的长度，培养基中添加0.2mg/l tdz，0.05mg/l iaa和1.0mg/l ga3不定芽增殖和伸长效果最佳，平均每个外植体产生30.1个不定芽，不定芽的平
均高度为2.8cm。
[0071]
表4植物生长调节剂种类和浓度对不定芽增殖和伸长影响
[0072][0073]
实施例6
[0074]
不定根诱导剂的种类、浓度及处理时间对祁源黄精组培伸长芽不定根形成的影响
[0075]
仅改变生根促进液中生根诱导剂的种类和浓度，以长势均一的株高为2-3cm的祁源黄精组培伸长芽为材料，将流水冲洗并吸干水分的组培伸长芽基部用添加有不同种类和浓度生根诱导剂的生根促进液中处理60s(步骤同实施例1)。培养3周后，统计祁源黄精组培伸长芽的不定根诱导率。
[0076]
表5结果表明不定根诱导液的种类和浓度对祁源黄精组培伸长芽不定根的诱导起着关键作用，所测试的3种植物生长调节剂单独使用均能提高祁源黄精不定根的诱导率，且它们之间存在一定的协同促进效用。其中以添加有750mg/l k-iba、500mm褪黑素、200mg/l iba的生根促进液的不定根的诱导效果最佳，不定根诱导率高达97.4％。
[0077]
表5不定根诱导液的种类和浓度对祁源黄精组培伸长芽不定根诱导的影响
[0078][0079][0080]
其次，仅改变祁源黄精伸长芽在生根促进液中的处理时间，以2-3cm长的长势均一健壮的祁源黄精伸长芽为外植体，将伸长芽从不定芽丛分离后经流水冲洗和表面消毒后，与实施例1中所涉及的生根促进液中处理不同时间(15s,30s,45s,60s,90s和120s)。其余步骤同实施例1。培养3周后，统计祁源黄精组培伸长芽的不定根诱导率。表6结果表明不定根诱导液处理时间对祁源黄精不定根的诱导起着重要作用。在一定处理时间内，随着处理时间的增加，不定根的诱导率逐步增加，处理60s时，不定根的诱导率高达97.4％。随着处理时间的增加，不定根的诱导率出现下降的趋势。具体如表6所示。
[0081]
表6不定根诱导液处理时间对祁源黄精组培伸长芽不定根诱导的影响
[0082]
处理处理时间(s)不定根诱导率(％)11531.623070.434581.746097.4
59091.1612083.6
[0083]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。