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一种以多花黄精茎节培育组培苗的方法

花匠小妙招
2024-11-12 11:06

1.本发明涉及植物组织培养领域，具体是一种以多花黄精茎节培育组培苗的方法。

背景技术：

2.多花黄精(polygonatumcyrtonema hua)为百合科黄精属多年生草本植物，是我国大宗的药食两用中药材，性平、味甘，入脾、肾、肺经，具有补肾益精、宽中益气、滋阴润燥、生津补脾之功效，长期用于治疗肾虚亏损，脾胃虚弱，肺虚燥咳，体倦乏力等症，也可用于治疗心血管疾病、结核病、慢性肝炎、心悸气短、久病津亏口干、糖尿病、高血压等病症，是150种中成药的重要组分，应用非常广泛。
3.多花黄精分布于长江以南大部分地区，虽然分布范围广，但由于药用资源仍以野生资源为主。随着人们生活水平提高，更加注重健康养生，多花黄精对许多现代慢性病有很好的治疗效果，且无毒副作用，可长期服用，导致市场需求量急剧增加，野生资源被乱采滥挖现象严重，野生蕴藏量急剧下降，人工栽培势在必行。
4.近年来，多花黄精开始了人工栽培，种苗主要是以种子苗和块茎苗为主。多花黄精种子虽多，但种子育苗的时间非常长，需要生长3年小苗才抽出带叶的茎成大苗，移栽到大田种植成活率才有保障。块茎苗的种源混杂，且存在病毒积累导致种性退化、易感病等问题，块茎运输易造成机械伤而腐烂，收获的产量和质量参差不齐。
5.植物组培技术具有提纯复壮、短时间内能生产大量种苗等优点，在作物种苗繁育中广泛应用。许多学者研究了黄精、多花黄精及滇黄精等黄精属植物的组培快繁技术研究，主要是以块茎上新芽或种子为外植体，由于植物组培技术具有保持原作物所有性状的特点，而种子或块茎芽处于多花黄精生长的幼苗期，导致即使是带有块茎的组培苗出瓶后，还需要1年时间的假植才能成为抽出茎的大苗，虽然比种子苗时间短2年，但比其它作物组培苗育苗时间长，因此，多花黄精的组培苗应用受到了很大限制。而且多花黄精的块茎新芽被切除后基本上不能再长芽，这个块茎不能作为种茎，只能作为药材使用，加上块茎芽生长在土壤里，微生物种类繁多，灭菌很难过关，易出内生菌，污染率高，增加组培苗的成本。

技术实现要素：

6.本发明针对多花黄精育苗时间长的问题，提出一种以多花黄精茎节培育组培苗的方法。该方法以多花黄精茎节为外植体，在初代诱导培养和继代增殖培养阶段，带茎叶的芽还可以剪成带节间的茎段进行丛生芽诱导，进一步提高增殖系数，通过壮苗培养使芽保持带茎叶的成苗状态，再进行生根结块茎培养，最终获得带茎叶的多花黄精组培苗，假植1
‑
3个月就可以移栽到大田种植，大大缩短了育苗时间，节省假植移栽的时间和场地，降低了育苗成本。
7.实现本发明目的的技术方案是：一种以多花黄精茎节培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体取材及预处理：取多花黄精幼嫩的茎芽，剪掉叶片，用洗衣粉水浸泡，不
时搅拌，再用流动清水冲洗干净，滤干水滴，备用；（2）灭菌及初代诱导培养：在超净工作台上，将多花黄精茎剪成带节间1 cm长的茎段，用0.1%升汞（hgcl2)溶液灭菌处理，无菌水清洗干净，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，剪去两头的旧伤口，接入初代诱导培养基上培养30 天，芽诱导率为62.1%～95.80%；所述初代诱导培养基为：ms+6
‑
ba0.5～2.0mg/l+zt0.1～0.7mg/l + tdz0.1～0.5 mg/l+iaa0.01～0.1 mg/l+谷氨酰胺0.2 mg/l+白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（3）继代增殖培养：在超净工作台上，将步骤（2）中诱导出的无菌芽剪成带节间的茎段，接入增殖培养基中培养30 天，茎段诱导出丛生芽中部分为单叶芽、部分为有茎叶的芽，增殖系数为3.2～5.9；所述增殖培养基为：ms+zt0.1～0.5 mg/l+6
‑
ba0.5～2.0 mg/l+naa0.01～0.1 mg/l+2,4
‑
d0.1～0.5 mg/l+白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（4）壮芽培养：在超净工作台上，取出步骤（3）中丛生芽，切分成有2个芽的小丛生芽，接入壮芽培养基中培养30 天，单叶芽长成带茎叶的芽，芽比较壮，芽高为2～5 cm；所述壮芽培养基为：ms+6
‑
ba0.5～2.0 mg/l+kt0.1～1.0mg/l + naa0.05～0.5 mg/l+白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（5）生根结块茎培养：将步骤（4）中得到带茎叶的丛生芽切分成单芽，接入生根结块茎培养基中培养60 天，获得有块茎的组培苗，块茎大小为0.4～1.2 cm，平均根数为5.4～24.1条；所述生根结块茎培养基为：1/2ms+naa0.5～2.0mg/l+iaa0.5～2.0 mg/l+da
‑
6 0.1～0.5 mg/l+白糖35 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；步骤（2）至（5）的培养条件是：培养温度为25
±
1℃, 光照时间为12小时/天，光照强度为2000 lx。
8.所述初代诱导培养基优选为：ms+6
‑
ba1.0mg/l+zt0.4mg/l + tdz0.3 mg/l +iaa0.05 mg/l+谷氨酰胺0.2 mg/l +白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8。
9.所述增殖培养基优选为：ms+zt0.3 mg/l+6
‑
ba1.0 mg/l+naa0.05 mg/l+2,4
‑
d0.3 mg/l +白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8。
10.所述壮芽培养基优选为：ms+6
‑
ba1.0 mg/l+kt0.5mg/l + naa0.2mg/l+白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8。
11.所述生根结块茎培养基优选为：1/2ms+naa1.0 mg/l+iaa1.0 mg/l+da
‑
6 0.2 mg/l+白糖35 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8。
12.所述培养基中，zt为玉米素，6
‑
ba为苄氨基嘌呤，kt为激动素，da
‑
6为胺鲜脂，2,4
‑
d为2,4
‑
二氯苯氧乙酸，tdz为噻重氮苯基脲，naa为a
‑
萘乙酸，iaa为吲哚
‑3‑
乙酸，试剂均为分析纯，水为超纯水。
13.所述培养基中植物生长调节剂不同种类和浓度组合，对多花黄精组培苗生长不同阶段产生不同效应。6
‑
ba有促进芽的形成和诱导愈伤组织发生的作用；zt能促进植物细胞分裂，阻止叶绿素和蛋白质降解，减慢呼吸作用，保持细胞活力等作用；2,4
‑
d具有促进多花黄精腋芽萌发作用；tdz可以促进植物芽的再生和繁殖，打破芽的休眠；谷氨酰胺具有促进细胞内蛋白质合成、促进细胞的生长和分化等作用；da
‑
6是一种高效的细胞分裂素，主要是促进作物生长，促进作物生根等功效；kt促进细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片衰
mg/l+谷氨酰胺0.2 mg/l +白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（3）继代增殖培养：在超净工作台上，将步骤（2）中诱导出的无菌芽剪成带节间茎段，接入增殖培养基中培养30 天，茎段诱导出丛生芽中部分为单叶芽、部分为有茎叶的芽，增殖系数为4.9；所述增殖培养基为：ms+zt0.5 mg/l+2.0 mg/l+naa0.1 mg/l+2,4
‑
d0.5 mg/l +白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（4）壮芽培养：在超净工作台上，取出步骤（3）中增殖芽，切分成有2个芽的小丛生芽，接入壮芽培养基中培养30 天，单叶芽长成带茎叶的芽，芽一般壮，芽高为2～5 cm；所述壮芽培养基为：ms+6
‑
ba2.0 mg/l+kt1.0mg/l + naa0.5 mg/l+白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（5）生根结块茎培养：将步骤（4）中得到带茎叶的丛生芽切分成单芽，接入生根结块茎培养基中培养60 天，获得有块茎的组培苗，块茎大小为1.0 cm，平均根数为17.2条；所述生根结块茎培养基为：1/2ms+naa2.0 mg/l+iaa2.0 mg/l+da
‑
6 0.5 mg/l+白糖35 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8。
19.实施例3：一种以多花黄精茎节培育组培苗的方法，包括以下步骤：（1）外植体取材及预处理：在晴天的上午剪幼嫩的茎芽，剪掉叶片，用洗衣粉水浸泡10 min，不时搅拌，再用流动清水冲洗20 min，滤干水滴，备用；（2）灭菌及初代诱导培养：在超净工作台上，将多花黄精茎剪成带节间1 cm长的茎段，再用0.1%升汞（hgcl2)溶液灭菌6 min，无菌水清洗5次，放到灭菌过的滤纸上吸干水分，剪去两头的旧伤口，接入初代诱导培养基上培养30 天，芽诱导率为95.80%；所述初代诱导培养基为：ms+6
‑
ba1.0mg/l+zt0.4mg/l + tdz0.3 mg/l +iaa0.05 mg/l+谷氨酰胺0.2 mg/l +白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（3）继代增殖培养：在超净工作台上，将步骤（2）中诱导出的无菌芽剪成带节间茎段，接入增殖培养基中培养30 天，茎段诱导出丛生芽中部分为单叶芽、部分为有茎叶的芽，增殖系数为5.9；所述增殖培养基为：ms+zt0.3 mg/l+6
‑
ba1.0 mg/l+naa0.05 mg/l+2,4
‑
d 0.3 mg/l +白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（4）壮芽培养：在超净工作台上，取出步骤（3）中增殖芽，切分成有2个芽的小丛生芽，接入壮芽培养基中培养30 天，单叶芽长成带茎叶的芽，芽壮，芽高为2～5 cm；所述壮芽培养基为：ms+6
‑
ba1.0 mg/l+kt0.5mg/l + naa0.2 mg/l+白糖30 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8；（5）生根结块茎培养：将步骤（4）中得到带茎叶的丛生芽切分成单芽，接入生根结块茎培养基中培养60 天，获得有块茎的组培苗，块茎大小为1.2 cm，平均根数为24.1条；所述生根结块茎培养基为：1/2ms+naa1.0 mg/l+iaa1.0 mg/l+da
‑
6 0.2 mg/l+白糖35 g/l+琼脂5 g/l，ph值为5.8。
20.实施例1～3所述步骤（2）至（5）的培养条件是：培养温度为25
±
1℃, 光照时间为12小时/天，光照强度为2000 lx。