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铁皮石斛DoUGT83A1基因克隆及表达特性分析

花匠小妙招
2025-10-31 20:33

铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo.是兰科石斛属多年生附生草本植物，主要分布于浙江、贵州、云南、福建等省，在我国已有两千多年的药用历史，为我国名贵中药材。铁皮石斛以干燥茎入药，还可用于煎汤、泡酒，广泛应用于食品、保健品等领域[1]，具有重要开发价值。《本草纲目》记载，铁皮石斛具有“补五脏虚劳，强阴益精”等功效。现代药理学证明，铁皮石斛含有多糖、生物碱、类、黄酮等多种活性成分，具有降血压、提高免疫、抗衰老等功效[2]。铁皮石斛体内多糖的生物合成是一个精细且复杂的过程，涉及一系列复杂的物质信号交互和基因表达的调控。糖基转移酶（glycosyl transferases，GTs）参与植物的糖基化反应，参与药用植物多糖合成过程，其家族数量众多，功能多样，已在拟南芥[3]、水稻[4]、番茄[5]等多个物种中被报道，可产生种类多样的具有生物活性的次级代谢产物，在植物激素调节、内源物质代谢及自我防御等方面具有重要作用[6-8]。

铁皮石斛多附生于海拔1 600 m以下的温暖湿润、空气畅通的半阴湿的树木或岩石上，在阳光直射的岩层峭壁上也可生长，有较强的环境适应性。环境因素是铁皮石斛的生长发育、产量的重要限制因子之一。低温造成的冷害、冻害会对铁皮石斛的生存、产量和品质造成严重影响。研究表明糖基转移酶基因受低温胁迫诱导表达上调，可能参与植物低温的抗性调控。沉默茶树UGT91Q2基因导致茶树抗寒性能力下降[9]，花生UGT83A1-like基因在低温胁迫下表达量上调[10]，铁皮石斛多糖合成相关基因（UAM、PGM、UGP、CSLA、RHM、SPS）在低温胁迫下呈现不同的表达模式[11]。除低温外，磷是植物生长发育过程中必需的一种大量营养元素，参与能量代谢、光合作用、信号转导等生物过程[12]。研究表明，糖信号可能参与植物对磷饥饿的反应。水稻AGPL1和AGPS1在磷饥饿时上调表达，通过增加淀粉、蔗糖等糖类的合成，从而释放合成路径中利用的磷酸基团供植物利用[13]。在缺磷胁迫下，铁皮石斛多糖含量高于正常磷供给处理，GH3基因家族成员在根和茎叶中的表达水平上调[14]，表明铁皮石斛多糖合成相关基因可能参与缺磷响应。植物主要通过根系的磷酸盐转运蛋白（主要是PHT1家族蛋白）从土壤中吸收磷酸盐，其他转录因子如MYB-CC转录因子PHR1及其同源基因PHL1、PHL2等在植物缺磷反应中也发挥了重要调控作用[15-16]。土壤中的磷极易被土壤吸附和固定，植物吸收利用率低，因此低磷通常成为植物生长发育的限制因素之一。在缺磷状态下，植物呈现植株矮小、生长缓慢、叶色暗绿、根系发育受阻等现象[17]。由于铁皮石斛自然繁殖率低，加之人类过度采挖和资源利用率低，野生铁皮石斛资源遭到严重破坏。近年来，大量研究表明，菌根真菌能与植物形成互惠共生关系，通过延伸的菌丝网络增加吸收面积，改善植物磷的吸收[18-19]，促进植物生长，提高其抗逆性。研究发现接种菌根真菌Mycenasp.能大幅度提高铁皮石斛的多糖含量，但延长了多糖的形成时间[20]。外施生物菌剂也可增加铁皮石斛多糖含量[21-22]。利用分子生物学手段对铁皮石斛多糖合成代谢通路中关键酶基因进行调控研究，对解析铁皮石斛多糖合成的分子机制具有深远意义。本实验从铁皮石斛中克隆了DoUGT83A1基因编码区（CDS）序列，对该基因进行生物信息学和组织表达特异性分析，明确了该基因在低温、菌根共生、缺磷环境处理下的表达特性，为深入研究DoUGT83A1基因功能及其在非生物胁迫应答中的表达调控机制奠定基础，为培育优质抗逆性铁皮石斛优良品种提供参考。

1 材料与仪器

1.1材料

供试植物材料为铁皮石斛“雁荡山1号”两年生驯化苗，在乐清市龙西乡北垟村浙江铁枫堂生物科技股份有限公司基地采收，经浙江省农科院亚热带作物研究所陶正明研究员鉴定为铁皮石斛D. officinale Kimura et Migo.驯化苗；菌根真菌摩西球囊霉Glomus mossesa购于北京农林科学院植物营养与资源研究所丛枝菌根真菌种质资源库（bank of glomeromycota in China，BGC），经实验室烟草扩繁获得接种物（丛枝菌根真菌的菌丝体、孢子果、孢子、黄沙、石英砂以及干枯植物根段）。

1.2仪器与试剂

2 ×Taq PCR Mix 、All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 试剂盒、DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、pMD18-T 载体、cDNA 反转录试剂盒、Real Time PCR 试剂盒、质粒DNA 抽提、DNA 胶回收、PCR 产物纯化试剂盒。PCR 引物合成委托北京擎科生物科技股份有限公司完成。

2 方法

2.1实验设计

将采收的铁皮石斛种苗洗净根部，取茎、叶、根组织，经液氮速冻后保存于−80 ℃冰箱备用，用于后续基因组织表达特性实验。每个样品3次生物学重复。其余种苗移栽入盆栽基质（黄沙、石英砂）中，每盆5株，每组设置3个重复。低温胁迫实验设低温组（0 ℃）、常温对照组（20 ℃），处理时间20 h，参照Wu等[23]研究方法；低磷胁迫实验设低磷处理组（0.01 mmol/L KH2PO4，LP）和常磷处理组（1.0 mmol/L KH2PO4，NP），处理时间6个月；菌根共生实验设置接菌组和不接菌组，处理时间6个月。将烟草扩繁接种物分别与盆栽基质混匀，保证每丛铁皮石斛周围有200个孢子左右。不接菌对照处理为接种等量灭活接种物。用25 μmol/L磷浓度的霍格兰营养液浇灌,每周浇1次营养液，每次浇灌至盆栽基质全部润湿为止。参照Liu等[24]研究方法，在28℃光照14 h /22 ℃黑暗10 h条件下共生培养3个月。上述实验每处理均设置3次生物学重复。

2.2 铁皮石斛总RNA提取和cDNA合成

参照改良的CTAB 法提取上述样品的总RNA ，利用Nanodrop 微量分光光度计检测其浓度。参照All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix 试剂盒说明书反转录合成单链cDNA 。

2.3 基因克隆与测序

2.4生物信息学分析

在NCBI 数据库提交克隆的DoUGT83A1 基因的氨基酸序列，进行BLASTp 比对筛选相似性高的其他物种同源序列。利用MEGA 11 软件的邻接法（neighbor joining ，NJ ）构建系统发育进化树。利用DNAMAN 软件对DoUGT83A1 及其同源蛋白进行氨基酸多序列比对；利用NCBI-CDD 在线预测DoUGT83A1 蛋白结构域，利用Pfam 进行保守结构域鉴定分析，利用MEME 软件分析DoUGT83A1 及其他物种UGT83A1 蛋白的保守结构域；运用ExPASy ProtParam 预测蛋白理化性质；使用SOPMA 进行蛋白二级结构分析，采用ProtScale 进行蛋白亲疏水性分析；采用SWISS-MODEL 预测蛋白三级结构，采用PyMod 插件对蛋白三级结构进行合理性评估；使用TMHMM 2.0 和Signal P 5.0 预测蛋白跨膜区和信号肽，利用CBS NetPhos 3.1 在线软件预测蛋白磷酸化位点。通过PlantCARE 网站预测启动子顺式作用元件。选择黄酮醇类的山柰酚作为底物，利用Autodock 软件将目标分子与DoUGT83A1 进行蛋白底物对接。

2.5组织表达特异性分析

花柱、花蕾、唇瓣、萼片、叶、茎、白根和绿根尖样本于2024 年6 月取自浙江铁枫堂生物科技股份有限公司铁皮石斛种植基地大棚中，自然条件下生长，为两年生成苗。利用荧光定量PCR （qRT-PCR ）分析DoUGT83A1 基因在不同组织器官中的表达情况。

2.6 不同胁迫处理下的转录组分析

利用qRT-PCR 分析DoUGT83A1 基因在菌根共生、低温和缺磷处理下的表达情况。

2.7数据处理与分析

采用WPS 2019 软件对数据进行处理，使用SPSS 21.0 进行统计分析，用Duncan’s 法进行多重比较，使用GraphPad Prism 9.5 软件作图。

3 结果与分析

3.1 DoUGT83A1基因克隆与序列分析

3.2 DoUGT83A1蛋白生物信息学分析

利用Pfam 及SMART 预测分析DoUGT83A1 蛋白结构，结果显示DoUGT83A1 蛋白共存在10 个开放阅读框（open reading frame ，ORF ）（图2 ），采用在线软件Prot Param 分析DoUGT83A1 基因编码蛋白的理化性质，DoUGT83A1 基因编码448 个氨基酸，分子式为C2422H3797N659O693S34 ，理论相对分子质量为54 330 ，理论等电点为5.75 ，不稳定指数为46.89 ，在第158 位甲硫氨酸（Met ）处具有亲水性最大值（2.611），在第179位丝氨酸（Ser）处具有亲水性最小值（−2.900），亲水性平均值为−0.015（图3-B），说明DoUGT83A1属于亲水性不稳定蛋白。对DoUGT83A1蛋白的跨膜区和信号肽结构分析，发现DoUGT83A1蛋白无信号肽和跨膜区结构区，表明DoUGT83A1属于非跨膜非分泌蛋白（图3-A、C）。对DoUGT83A1蛋白进行磷酸化位点分析，结果表明DoUGT83A1含有41个蛋白磷酸化位点，其中包括31个丝氨酸（Ser）位点和10个苏氨酸（Thr）位点（图3-D），说明该蛋白的磷酸化修饰以丝氨酸为主。运用在线工具SOPMA预测蛋白二级结构，结果显示，DoUGT83A1蛋白的二级结构由40.95% α-螺旋、13.58%延伸链和45.47%无规则卷曲组成（图4-A），主要以α-螺旋和无规则卷曲组成为主；利用在线分析软件SWISS-MODEL预测蛋白三级结构（图4-B）。DoUGT83A1与其他植物UGT83A1同源蛋白系统进化树分析见图4-C，系统进化树结果表明，DoUGT83A1蛋白与金钗石斛Dendrobium nobile的UGT83A1蛋白聚为一支，亲缘关系较近，可能具有类似的功能。DoUGT83A1与其他植物UGT83A1保守基序分析见图4-D，结果表明7个UGT83A1蛋白在C端存在一个由44个氨基酸残基组成的UDP-糖基转移酶保守结构域，即C末端保守区域PSPG盒—HCGMNS。DoUGT83A1与兰科植物UGT83A1的氨基酸序列具有较高的一致性，与金钗石斛的UGT83A1蛋白的同源性最高，相似度为96.36%。为探究DoUGT83A1的底物特异性，选择黄酮醇类成分山柰酚（kaempferol）作为底物，与DoUGT83A1蛋白进行分子对接。对接结果如图6所示，DoUGT83A1与山柰酚的结合亲和力为−7.08 kJ/mol，预测DoUGT83A1蛋白与山柰酚具有较好的酶活反应潜力。

3.3 DoUGT83A1启动子顺式作用元件分析

本研究利用PlantCARE软件对铁皮石斛DoUGT83A1基因启动子进行分析。结果表明，铁皮石斛DoUGT83A1启动子上中存在多个参与生理代谢和环境胁迫的顺式作用元件（表2），例如，启动子区域包括核心启动元件（TATA-box、CAAT-box）；ABA响应元件（ABRE）；MeJA响应元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）；GA3响应元件（GARE-motif）；低温响应元件（LTR）。由此推测铁皮石斛DoUGT83A1基因在低温响应、光响应表明DoUGT83A1可能在调控铁皮石斛生长发育和抵御非生物胁迫中可能发挥重要作用。

3.4 DoUGT83A1基因组织特异性表达特性分析

为了进一步分析铁皮石斛DoUGT83A1 基因的时空表达特性，利用qRT-PCR 检测了DoUGT83A1 基因在铁皮石斛不同组织中的表达情况。结果显示，DoUGT83A1 基因在铁皮石斛不同组织器官中均有表达（图7 ），相对表达量存在明显差异，在叶中表达量最高，其次为茎，再者为花，在根组织（白根和绿根尖）中表达量最低。基因在植物不同部位的表达情况与其功能存在一定的联系[25-26] 。由此推测DoUGT83A1 在叶中高表达可能暗示其在铁皮石斛叶的生长发育中发挥重要的调控作用。

3.5 DoUGT83A1基因在低温、缺磷、菌根共生下的表达特性分析

利用PlantCARE软件预测DoUGT83A1基因的启动子序列，结果显示DoUGT83A1基因上游启动子区中含有多种植物激素及环境因子相关的顺式作用元件。因此对DoUGT83A1基因在低温、缺磷、菌根共生处理下的表达模式进行分析。qRT-PCR结果（图8）表明，DoUGT83A1基因受低温、缺磷、菌根共生诱导表达显著上调表达，表达模式基本一致，提示该基因可能在铁皮石斛低温相应和缺磷耐和菌根共生途径过程中发挥重要功能。本研究中检测了低温、缺磷、菌根共生实验中铁皮石斛中多糖含量，由表3可知，3种处理均能提高铁皮石斛多糖含量。

4 讨论

DoUGT83A1 为亲水性不稳定蛋白，在进化上与金钗石斛、鼓槌石斛、球花石斛UGT83A1 等兰科植物的亲缘关系最近，表明兰科植物的蛋白序列和结构在进化过程中可能相对保守。此外，DoUGT83A1 肽链中含有41 个磷酸化位点，其中31 个Ser 位点，由此可以推测该蛋白发生磷酸化时可能以Ser 磷酸化为主，从而在多种生物学活动和分子功能方面发挥重要的调控作用。

研究发现，UGT 在植物不同发育时期和不同组织中的表达也具有时空特性。基因的组织特异性与其功能存在一定联系。例如CLSY1-4 基因在拟南芥花序、胚珠、真叶等组织中呈现明显的组织特异性，对特定的CLSY位点突变可改变组织间的表观遗传[30]。张岗等[31] 发现铁皮石斛蔗糖转运蛋白基因DoSUT1 在叶、茎表达量为根组织的2.783 和2.150 倍，该基因可能主要调节铁皮石斛茎中糖转运与贮存。本研究克隆得到的DoUGT83A1 基因在铁皮石斛不同组织器官中表达水平也存在显著差异，相对表达量为叶＞茎＞花＞根，说明该基因可能在铁皮石斛叶器官生长发育及体内各器官间糖转运与贮存的过程中发挥重要功能。

目前在铁皮石斛功能基因的相关研究中，参与多糖代谢和运输的基因包括尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-Glucose Pyrophosphorylase ，UG Pase ）、纤维素合成酶样A6 （cellulose synthase-like A ，DoCSLA6 ）、蔗糖转运蛋白（sucrose transporter ，DoSUT1 ）、GDP 甘露糖焦磷酸化酶（GDP-mannose pyrophosphorylase ，DoGMP1 ）、DoSWEET 蛋白（sugars will be eventually exported transporters ，DoSWEET1 ）、碱性/ 中性转化酶己糖转运蛋白[ （alkaline/neutral invertase ，DoNI2 ）、（hexose transporter ，DoHT1 ）] 、可溶性酸性转化酶（soluble acid invertase ，SAI ）[32] 。

UGT基因作为多糖合成途径下游关键酶基因，在植物生长发育、次生代谢产物修饰及非生物胁迫响应中发挥着重要调控作用。大豆中催化类黄酮糖基化的糖基转移酶基因，能够促进大豆根系生长[33] 。水稻OsSQD2.2 催化芹菜素发生糖基化，超表达后具有增加叶片中次生代谢产物含量，降低水稻生物量、结实率[34] 。本研究中通过分析DoUGT83A1 基因在不同胁迫条件中的表达情况，更好地理解铁皮石斛DoUGT83A1 基因在非生物胁迫中的作用。DoUGT83A1 的启动子序列被证明含有响应多种非生物胁迫源（如光、温度、干旱等）的反应，以及多种激素响应相关的顺式作用元件，表明DoUGT83A1 基因可能参与对一系列胁迫源的响应。越来越多的UGT基因已被证明具有抗寒功能，包括AhUGT83A1-like、CsUGT91Q2、NtUGT90等[9-10,35]。本研究中发现DoUGT83A1 受低温、缺磷诱导、菌根共生上调表达，提示该基因在抵御非生物胁迫和菌根共生过程中可能发挥重要调控作用，与前人研究相符。随着气候变化逐渐加剧，全球生态环境正面临严峻挑战。铁皮石斛DoUGT83A1 基因的克隆和分析对研究植物响应非生物胁迫与菌根共生的具体机制具有重要意义，有利于阐明DoUGT83A1 在抵御非生物胁迫和菌根共生途径中的功能和分子机制，为进一步定向优化铁皮石斛药材品质奠定基础。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：张逸群，陈家栋，宋敏全，姜武，刘莹莹，段晓婧，陶正明．铁皮石斛DoUGT83A1基因克隆及表达特性分析 [J]. 中草药, 2025, 56(1): 259-268.