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新型分子探针助推中药药效物质发现: 中国药科大发现葛根素显著降低急性肾损伤的对羟自由基水平

花匠小妙招
2026-01-07 06:06

各位热爱科研的小伙伴们，今天为大家介绍的是2023年10月23日发表在Advanced Science（最新IF: 14.3）的研究文章。该文章由中药学院田蒋为团队完成。题为“Illumination of Hydroxyl Radical in Kidney Injury and High-Throughput Screening of Natural Protectants Using A Fluorescent/Photoacoustic Probe”。该团队开发新型分子探针技术，发现葛根素显著降低急性肾损伤的对羟自由基水平。

文章概况

羟基自由基（-OH）在急性肾损伤（AKI）的发生和发展中起着至关重要的作用。因此，开发一种稳健的 -OH 探针对于 AKI 的早期诊断、天然保护剂的高通量筛选 (HTS) 以及阐明 AKI 干预的分子机制大有可为。该研究报告了一种可激活的荧光/光声（PA）探针（CDIA）的设计与合成，该探针可用于对 AKI 中的-OH 进行灵敏和选择性成像。CDIA 具有近红外荧光/PA 通道和快速激活动力学，能够检测 AKI 模型中 -OH 的发生。使用该探针的阳性检测时间为 12 小时，优于血尿素氮和血清肌酐检测等典型临床检测方法的 48 小时检测时间。此外，还利用 CDIA 建立了中药天然-OH 抑制剂的 HTS 方法。通过激活 Sirt1/Nrf2/Keap1 信号通路来保护 AKI 中的肾细胞，筛选出了葛根素。总之，这项工作为阐明 AKI 中与 -OH 相关的病理过程以及筛选更多预防和治疗 AKI 的化合物提供了一个多功能的双模式工具。

图1：近红外荧光/光声探针 CDIA 的设计示意图，用于监测 AKI 中的-OH，并展示抗氧化天然产品的 HTS 战略，以减轻 AKI。

主要内容

CDIA探针的构建

CDIA探针的构建涉及三个主要步骤：首先，合成对称菁染料CyCl；其次，通过逆转录knoevenagel反应合成半菁前体CyOH；最后，将CyOH与3,5-二碘水杨酸偶联制备得到最终探针CDIA。整个构建过程通过NMR谱和质谱技术验证，确保探针CDIA的成功合成，其分子量为674.55。

CDIA探针的应用

CDIA探针在•OH检测方面展现了出色的性能。初始状态下，CDIA非荧光，但在暴露于•OH后，其光谱特性发生显著变化，不仅吸收峰位移，而且在720 nm处的荧光强度显著增加。这种高灵敏度和特异性的响应使CDIA成为检测•OH的有力工具。此外，CDIA探针还通过智能手机的RGB图像分析实现了体外•OH的比例成像，为•OH浓度的可视化测量提供了便捷方法。更重要的是，CDIA探针被用于比较和量化几种典型•OH清除剂的清除效率，为深入了解这些化合物的抗氧化性能提供了新途径。这些研究不仅证明了CDIA探针在生物和化学系统中的潜在应用价值，还为其在更多领域的应用奠定了基础。

图2：CDIA法体检测•OH。

CDIA探针在活细胞•OH检测中的应用

CDIA探针在确认具有良好的细胞相容性后，成功应用于检测培养细胞中的•OH。在肾毒性药物顺铂处理的HK-2细胞中，CDIA显示出显著增强的近红外荧光信号，表明其适用于药物性细胞损伤成像。共染色实验揭示CDIA主要定位于线粒体区域，与阳离子荧光探针在活细胞中的选择性积累行为一致。CDIA在多种模型细胞如RAW264.7小鼠巨噬细胞和HeLa细胞中也显示出对内源性•OH的高灵敏度检测能力，进一步证明了其作为一种有效的细胞内•OH成像工具的潜力。此外，通过将CDIA封装在低分子量壳聚糖(LMWC)中制备的纳米探针CDIA@LMWC NP，不仅具有优异的肾细胞靶向性，还能够在生理条件下保持稳定，并通过巨噬蛋白受体介导的内吞作用选择性地内化到溶酶体中，进而在酸性环境中释放CDIA，展示了其在活细胞PA成像中的巨大应用潜力。

图3：•CDIA活细胞的OH通量。

CDIA@LMWC NP用于筛选抗氧化剂

研究者利用CDIA@LMWC NP建立了一个HTS平台，用于筛选能够减少•OH形成的抗氧化剂。通过预处理HK-2细胞并随后用CDIA@LMWC NP进行成像分析，研究者发现部分天然产物如葛根素能够显著减少荧光信号，表明其下调•OH生成的能力。这一结果表明CDIA@LMWC NP是一种有价值的工具，可以快速发现天然产物中潜在的AKI治疗药物。

图4：含CDIA@LMWC NP的天然产物对活HK-2细胞AKI的HTS。

CDIA@LMWC NP在AKI双模态成像中的应用

CDIA@LMWC NP在小鼠模型中显示出良好的体内稳定性和低毒性，使其成为监测肾脏疾病的理想候选。利用CDDP作为肾毒性模型，展示了CDIA@LMWC NP能够通过近红外荧光和光声成像双模态技术，实时监测肾脏损伤的进程。这种双模态成像方法不仅提供了关于肾脏损伤状态的直接信息，还通过尿液信号反映了短暂性肾损伤的程度。该研究结果表明，CDIA@LMWC NP在早期诊断AKI方面具有巨大潜力，并可能帮助优化治疗策略。

图5：DIAKI在体内的近红外荧光和PA成像。

葛根素对AKI保护作用的分子机制

进一步研究表明，葛根素（Pue）在体内外均展现出对急性肾损伤（AKI）的保护作用。通过双模态成像技术，观察到Pue预处理能够显著降低由顺铂（CDDP）诱导的肾损伤小鼠的近红外荧光强度和光声振幅，这与肾切片的病理分析结果一致。深入探究其分子机制，发现Pue通过上调Sirt1和Nrf2等抗氧化相关基因的表达，以及增加DJ-1、HO-1等抗氧化蛋白的水平，同时降低Keap1的表达，从而恢复氧化还原稳态，减少ROS的产生，并抑制ROS相关失衡。这些结果表明，Pue可能是一种潜在的AKI治疗药物，其通过调节抗氧化防御通路中的关键蛋白表达来发挥保护作用。

图6：Pue对cddp诱导的AKI的拮抗作用。

小结

研究者们已经创建了一种探针，可以通过激活近红外荧光和光声信号来响应•OH从而检测急性肾损伤（AKI）。该双模态成像探针包括近红外半花青碱染料(CyOH)与•OH响应底物碘水杨酸偶联。该探针具有高敏感性和特异性，具有快速的活化动力学和高的生物相容性。通过引入LMWC来增强肾脏靶向性，CDIA@LMWC NP无需任何主动干预即可在肾脏中积累，并触发其荧光和光声信号，从而指示AKI相关的氧化应激水平。使用此探针能在12小时内获得阳性结果，优于典型临床检测所需的48小时。此外，CDIA@LMWC NP在筛选草药中的天然•OH清除剂方面展现出卓越的能力，揭示了天然产物在减轻AKI中的化学调节机制。进一步研究表明，筛选出的天然抗氧化剂葛根素（Pue）通过分解CDDP诱导的•OH来保护肾细胞，并激活Sirt1/Nrf2/Keap1信号通路，调节ROS相关基因，从而恢复肾细胞的氧化还原稳态。鉴于其制备简单和反应活性，研究者们预测双模态成像探针CDIA@LMWC NP可能成为检测临床AKI和其他ROS相关疾病的潜在选择，从而提高整体诊断效能。