首页 > 分享 > 柴胡药效成分的提取及基于抗氧化保肝作用研究

柴胡药效成分的提取及基于抗氧化保肝作用研究

花匠小妙招
2024-11-03 08:07

摘要

研究背景:中药柴胡(Bupleurum Chinennse)为伞形科植物柴胡(Bupleurum Chinennse DC.)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根,具有疏散退热、疏肝解郁、升举阳气的功效。近年来,以柴胡为君药的复方制剂柴胡疏肝散、小柴胡汤、柴胡理中汤等广泛用于预防及治疗肝脏疾病方面,具有显著的疗效。在肝脏疾病方面,非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是全球最常见的慢性肝病之一,其发病机制复杂,中医理论以肝肾脾阴阳失衡为本,将NAFLD分为肝郁气滞、肝肾阴虚、肝阳痰火等证型;现代医学认为,氧化应激是NAFLD发生发展的影响因素之一,是机体氧化与抗氧化系统失衡,其与中医阴阳失衡状态相似,随着氧化应激状态的持续,除肝硬化、肝细胞癌外,还会增加心血管疾病发生的风险,因此干预NAFLD早期阶段有助于改善患者生存质量。目前,西药治疗NAFLD治疗靶点单一,尚无特效药,而中药具有多成分、多途径和多靶点的特点,关于柴胡相关复方制剂临床广泛用于治疗慢性肝病,可改善肝功能异常,但关于柴胡保肝作用的物质基础及作用机制尚不明确。本研究以柴胡为研究对象,通过提取并比较柴胡不同极性部位及主要活性成分的自由基清除能力、铁还原力和对肝细胞氧化损伤的保护作用,评价柴胡基于抗氧化发挥保肝的作用及探索其活性成分柴胡皂苷d(Saikosaponin d,SSd)对核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)及血红素加氧酶1(Heme oxygenase 1,HO-1)信号分子的影响,为柴胡综合利用及制剂开发奠定理论基础。研究目的:初步探索柴胡基于抗氧化发挥保肝的作用及活性成分SSd对Nrf2及HO-1信号分子的影响,为柴胡资源的合理运用及制剂的研发、质量控制和临床研究奠定理论基础。研究方法:1.柴胡不同极性部位的提取及体外抗氧化活性研究采用蒸馏水回流提取柴胡水部位、70%(v/v)乙醇回流提取及萃取法等提取不同极性部位(乙醇部位、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位);通过水杨酸法、DPPH法、ABTS法及总还原力测定法评价柴胡不同极性部位体外自由基清除能力及铁还原力;通过过氧化氢(H2O2)诱导,建立肝细胞氧化损伤模型,测定细胞存活率、抗氧化酶活性及丙二醛等指标,评价各极性部位对人正常肝细胞(LO2细胞)氧化损伤的保护作用;2.柴胡主要活性成分的提取及体外抗氧化活性研究采用水提醇沉法、碱溶酸沉法、水蒸气蒸馏法分别提取柴胡多糖、黄酮、挥发油,并通过苯酚硫酸法、紫外分光光度法进行含量测定;通过DPPH法和ABTS法测定柴胡多糖、黄酮、挥发油、皂苷的自由基清除能力,比较其体外抗氧化能力;测定细胞存活率、抗氧化酶活性及丙二醛等指标,考察柴胡多糖、柴胡黄酮、柴胡皂苷对H2O2诱导LO2细胞氧化损伤的保护作用;3.SSd对H2O2诱导的LO2细胞氧化损伤的保护作用研究通过测定细胞存活率、肝细胞损伤指标、丙二醛及活性氧的变化水平,Nrf2及HO-1信号分子的表达水平,探索SSd对H2O2诱导LO2细胞氧化损伤的保护作用及潜在机制。研究结果:1.柴胡不同极性部位的提取及体外抗氧化活性研究100 g柴胡饮片提取柴胡5种极性部位得到柴胡水部位11.36 g、乙醇部位14.01 g、正丁醇部位1.86 g、乙酸乙酯部位1.74 g及石油醚部位1.48 g;柴胡的5种极性部位均有较好的抗氧化能力,其中乙酸乙酯部位抗氧化活性最强,其羟自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分别为0.177 mg/mL、0.171 mg/mL、0.095 mg/mL,铁还原能力A0.5为0.491mg/mL。各部位在不同体外抗氧化活性评价中的综合能力顺序为:乙酸乙酯部位>水部位>乙醇部位>正丁醇部位>石油醚部位;柴胡的5种极性部位对肝LO2细胞氧化损伤的保护作用实验结果显示,800μmol/LH2O2作用LO2细胞24 h后,细胞存活率显著下降至(51.09±2.21)%(P<0.001),通过给予柴胡不同极性部位预处理后,柴胡水、乙醇、正丁醇及乙酸乙酯部位具有显著的保护作用,其中乙酸乙酯部位(24μg/mL)的细胞存活率提升至70.63%,GSH-Px和SOD酶活性显著提高至15.44 U/mg和49.43 U/mg(P<0.05),MDA含量显著减少至1.85μmol/g(P<0.05),石油醚部位(24μg/mL)对H2O2诱导LO2细胞氧化损伤的保护作用不明显。2.柴胡主要活性成分的提取及体外抗氧化活性研究提取得到柴胡多糖浓度为5.78 mg/mL,柴胡黄酮占比61.7%,柴胡挥发油浓度为1.8938 g/mL,柴胡皂苷为购买品,纯度为70%;柴胡多糖、柴胡黄酮和柴胡皂苷的自由基清除能力显著优于柴胡挥发油;在柴胡3种活性成分对LO2细胞氧化损伤保护实验中,柴胡多糖(6.936μg/mL)、柴胡黄酮(32μg/mL)和柴胡皂苷(60μg/mL)组可提高LO2细胞存活率至63.92%、60.85%和67.47%,差异均具有统计学意义(P<0.05),GSH-Px和SOD酶活性显著提高至15.81、17.10、17.06 U/mg和46.79、47.11、52.05 U/mg(P<0.05),MDA含量显著减少至2.34、2.28和2.11μmol/g(P<0.05);3.SSd对H2O2诱导的LO2细胞氧化损伤的保护作用研究结果显示H2O2800μmol/L作用LO2细胞24h,细胞存活率显著下降至(51.09±2.21)%,给予SSd(1、2μmol/L)预处理LO2细胞后,细胞存活率分别提高至(61.92±1.65)%和(64.99±2.58)%(P<0.05);与对照组相比,H2O2组使ALT,AST,LDH和MDA含量提高至11.70 U/L,33.70 U/L,570.75 U/L和3.97μmol/g(P<0.05),ROS显著升高,SSd(2μmol/L)可减低损伤指标至7.27 U/L,19.04 U/L,478.39 U/L和1.75μmol/g(P<0.05),细胞内ROS水平显著降低;与对照组相比,SSd(2μmol/L)显著促进Nrf2的核转位水平,与阳性药物叔丁基对苯二酚(tBHQ,50μmol/L)效果相当;与H2O2组相比,预先给予2μmol/L SSd增加细胞Nrf2和HO-1蛋白的表达(P<0.05)。研究结论:1.柴胡不同极性部位及主要活性成分的提取及含量测定方法,操作简单、显色稳定、灵敏度高、重复性好;2.柴胡发挥抗氧化保肝作用可能与其主要药效活性物质群皂苷、多糖、黄酮类相关;3.柴胡皂苷d对H2O2诱导氧化损伤的LO2细胞具有保护作用,可能与增加Nrf2及HO-1信号分子的表达有关。展开▼