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无病毒植物的培养.pptx

花匠小妙招
2026-04-16 08:08

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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,教学目标和要求,(1）了解植物病毒危害和培养无病毒植物意义,（2）了解和掌握脱除植物病毒原理及方法,（3）了解分离茎尖培养情况,（4）普通掌握无毒苗木判定方法,（5）普通掌握脱毒苗木保留和利用方法,无病毒植物的培养,第1页,第一节植物病毒危害和培养无病毒植物意义,病毒之所以致病不是因为消耗细胞养分或经过毒素杀死细胞，而是利用细胞内物质占领空间，,干扰细胞代谢过程,，促使细胞产生一些对细胞或生物生命和正常功效,有害异常物质和条件，,这使得植物病毒病防治较其它植物病害防治更为困难，常给生产带来灾难损失，被称为,“植物癌症,”,无病毒植物的培养,第2页,一、植物病毒危害,植物病毒已超出600种,，严重危害着农业生产,在,果树、蔬菜、花卉、林木以及农作物上皆有发觉,伴随生产栽培时间推移，危害越来越严重，发觉病毒种类也越来越多,无病毒植物的培养,第3页,病毒调查,无病毒植物的培养,第4页,无病毒植物的培养,第5页,危害园艺植物病毒数目,无病毒植物的培养,第6页,如侵染菊花病毒和类病毒有19种之多,如无子病毒(CAV),潜隐病毒(CLV),B病毒(CVB),轻斑驳病毒(CMMV),矮化病毒(CSV),脉斑驳病毒(CVMV),退绿斑驳类病毒(CCMV)等,无病毒植物的培养,第7页,4种对草莓生产造成重大影响:,斑驳病毒（SMoV）,草莓黄边病毒（SMYEV）,草莓镶脉病毒（SVBV）,草莓皱缩病毒（SCrV）、,无病毒植物的培养,第8页,甘薯根腐病.,甘薯叶点病,甘薯枯萎病,甘薯黑痣病,无病毒植物的培养,第9页,2.病毒特征及其侵染,多植物病毒,不经种子,传输，多数以种子繁殖后代植物，能够从轻度罹病植株上采集种子，播种繁殖，不会将病毒传至下一代,。

（专化性强病毒除外，如豆类病毒由一个专化性强蚜虫传输)可伴随种子传输）,对于有性生殖退化，仅能用无性繁殖方法繁殖植物，一旦罹病则毫无方法母株一旦染病，病毒在其细胞内增殖，并,经过插条、接穗、种薯、球根、鳞片传至下一代,经过,昆虫,作为媒介加速传输,无病毒植物的培养,第10页,.植株脱病毒意义,植物组织培养脱病毒技术是植物细胞工程主要组成部分，脱毒种苗生产在,提升作物质量和产量,方面已显示出极大潜力，,良种、新品种脱毒组培苗大面积推广和应用,，有效地处理了因病毒引发品种,退化,问题所以，植物组培脱毒技术在农业生产科学化、当代化中含有巨大应用价值和经济效益，还可降低农药施用，,改进生态环境条件，预防病害蔓延与扩散，,该方法已成为农业中应用最广泛生物技术,无病毒植物的培养,第11页,甘薯脱毒苗,无病毒植物的培养,第12页,脱毒区,无病毒植物的培养,第13页,第,二节脱除植物病毒原理及方法,一、物理学方法：,X射线,紫外线,超短波,高温,都能使病素钝化，其中以热处理最惯用,无病毒植物的培养,第14页,1.热处理脱除植物病毒原理,病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后；随植物细胞DNA一起复制。

热处理并不能杀死病毒，只能,钝化病毒活性,，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停顿，而失去侵染能力,热处理是一个物理效应，与冷处理一样，它能够加速植物细胞分裂，使植物细胞在与病毒繁殖竞争中取胜,无病毒植物的培养,第15页,（1）温汤浸渍处理法：,将剪下接穗或种植材料，在50左右温水中，浸渍3-15分钟至数小时,（2）热风处理法：,让盆载植物在35-40高温下生长发育，热处理空气温度应逐步升高，然后到达所需温度，同时必须保持一定湿度和光照，以后可切取处理后新长出枝条作接穗和砧木，或将热处理与组织培养结合效果更加好,热处理脱毒,无病毒植物的培养,第16页,2、愈伤组织热处理脱毒法,方法：,从患病植株上取叶片(茎片、鳞片、花器亦可)进行离体培养，诱导形成愈伤组织，然后将愈伤组织重复继代培养同时兼用热处理,惯用处理温度及处理时间：,温度：37-38 时间：处理2周、4周或8周,温度：50 时间：3-15min,重复继代兼热处理，经历一定时间(继代次数需试验)后，将热处理过愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化,无病毒植物的培养,第17页,果树作物：,桃(无黄萎病)、苹果(花叶病)、葡萄(扇叶病毒)、甜橙、香蕉、李子、醋栗、梨、树莓、红莓苔子、草莓等。

,蔬菜作物：,马铃薯、番茄、菠菜,花卉植物：,蔓生长春花、康乃馨、菊花等,其它植物：,曼陀罗等,无病毒植物的培养,第18页,例：烟草愈伤组织兼热处理钝化烟草花叶病毒,(TMV),和黄瓜花叶病毒(CMV)取得无病毒株效果做法：,A：从患病烟草植株上取5mm叶片培养，在MS附加IAA 2+KT 0.2培养基上诱导愈伤组织,B：将其中一部分愈伤组织重复继代培养，继代培养中分别兼用25、30和37温度热处理8周,,C：将热处理后愈伤组织，转到MS附加IAA 2+KT 2分化培养基中诱导芽分化,D：将1cm长芽转移到MS附加IAA 2+KT 0.02生根培养基，诱导根分化,E：完整植株取得后，移植到无毒土壤栽培并进行判定,结果表明：重复继代培养可取得无病毒株,无病毒植物的培养,第19页,3.低温处理脱出病毒,菊花植株-5,4-7.5个月处理后进行茎尖培养,能够除去矮化病毒(CSV)和褪绿班驳病毒(CCMV),而单独茎尖培养无此效果,无病毒植物的培养,第20页,二、化学方法,使用农药是防治植物真细菌病害主要方法，理论上讲，也应该是防治病毒有效路径,有不少化学物质能抑制病毒复制，比如孔雀绿、硫尿嘧啶、8-氮鸟嘌呤、以及一些病毒抑制剂。

,如Viraz01e(病毒唑)和一些蛋白质、核酸合成抑制剂等因为病毒复制和寄主代谢过程关系非常亲密，所以，要找出既干扰病毒复制，又不影响寄主细胞正常代谢药剂十分困难,无病毒植物的培养,第21页,利用这些化合物处理整株植物去病毒效果虽不理想，但,培养离体组织、细胞和原生质体等却可能有良好效果,,如在培养基中加入,2硫尿嘧啶,能够除去烟草愈伤组织中PVY病毒，加入,放线菌素D,能够抑制原生质体中病毒复制等,无病毒植物的培养,第22页,钝化、抑制和去除植物病毒一些化合物,无病毒植物的培养,第23页,三、生物学方法,1.茎尖培养脱毒,（1）茎尖培养脱毒理论基础,a、病毒在植物体内转移是经过维营束系统完成，在分生组织区域内没有维管束组织，病毒只能经过胞间连丝传递赶不上细胞不停分裂和活跃生长速度；,b、在分裂旺盛分生组织内，病毒复制受到旺盛代谢活动限制；,c、在植物分生区域内，“病毒钝化体系”活性较其它部位活性高；,d、茎尖分生组织内高浓度植物内源激素可能会抑制病毒增殖,无病毒植物的培养,第24页,（2）茎尖培养脱毒苗方法,在解剖镜下剥取茎尖考虑到脱毒效果及提升成活率，普通切取,0.20.5mm,茎尖为组织材料进行培养，不一样植物茎尖对外源激素反应不一样。

,茎尖大小:,过大时接种易成活，但脱毒效果差，过小时难成活，但脱毒效果好普通以带有1-2片叶原基为好，大小为0.2-0.3mm为宜，超出0.5mm时，脱毒效果差,培养基:,只要能使茎尖快速生长，分化快培养基均适于脱毒普通以MS很好，添加一定百分比细胞分裂素就行,无病毒植物的培养,第25页,马铃薯芽,无病毒植物的培养,第26页,茎尖结构,无病毒植物的培养,第27页,微茎尖,普通茎,尖,无病毒植物的培养,第28页,马铃薯脱毒苗,无病毒植物的培养,第29页,无病毒植物的培养,第30页,康乃馨不一样茎尖培养与康乃馨斑驳病毒脱除情况,无病毒植物的培养,第31页,(3)茎尖培养法脱除植物病毒技术关键,同一个病毒在不一样植物体内分布部位不一样,例：烟草花叶病毒(TMV)在以下植物中荧光反应,烟草：l-4片叶原基中未见TMY特异荧光,撞羽矮牵牛：一两片叶原基未见TMV特异荧,光，而在三四片叶原茎中可见TMV荧光,番茄：1片叶原茎中未见TMV特异荧光,所以在用茎尖培养脱毒时，必须认真确定病毒在植物茎尖中分布部位，然后确定培养茎尖大小.,无病毒植物的培养,第32页,如：番茄：只能取生长锥或仅带一片叶原基茎,尖进行培养；,撞羽矮牵牛：可取生长锥或带一两片叶原基,茎尖进行培养；,烟草：可取带4片叶原基茎尖进行培养。

,利用茎尖堵养法脱除植物病毒时，最好找出茎原基所带叶原基数目与生长点(茎尖)大小相关性，这么在取材时就方便多了,无病毒植物的培养,第33页,茎原基 0.050.08mm,茎原基带2片叶原基 0.10.2mm,茎原基带4片叶原基 0.30.4mm,茎原基带6片叶原基 0.60.8mm,无病毒植物的培养,第34页,不一样病毒种类在同一个植物中分布部位不一样,无病毒植物的培养,第35页,甘薯,斑纹花叶病毒、缩叶花叶病毒：,分布于1.0-2.0mm以内茎尖中,羽毛状花叶病毒：,分布于0.3-1.0mm以内茎尖中,马铃薯,马铃薯卷叶病毒、Y病毒：,分布于1.0-3.0mm以内茎尖中；,X病毒：,分布于0.2-0.5mm以内茎尖,G病毒：,分布于0.2-0.3mm以内茎尖,S病毒：,0.2mm以下,无病毒植物的培养,第36页,2.愈伤组织培养脱毒,植物各部位器官和组织培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株，能够得到无病毒苗,说明病毒颗粒会在愈伤组织培养过程中逐步消失,无病毒植物的培养,第37页,愈伤组织脱病毒机理,可能原因有：,病毒在植物体内不一样器官或同一器官不一样组织中分布不均匀，由那些无病毒细胞增殖产生愈伤组织就是取得无病毒苗基础。

,有些愈伤组织细胞中病毒浓度较低，在愈伤组织细胞快速分裂过程中，病毒复制能力衰退或丢失,继代培养愈伤组织轻易产生抗性变异细胞，因而可能出现不带病毒愈伤组织但经愈伤组织产生无病毒苗脱毒路径轻易产生变异，可能造成植株丧失其原有优良性状，当然也有可能产生有益变异，但频率极低,无病毒植物的培养,第38页,3.茎尖微体嫁接脱毒,先将砧木种子进行表面消毒，以后再接到1%琼脂以MS无机盐培养基培养发芽，用苗龄约2周幼嫩实生苗作砧木,把实生苗从试管中取出，在无菌条件下切去顶部，留下1-1.5cm上胚轴部分，将子叶和液芽除去，把根切短至46cm长,从田间或温室旺盛生长成年树剪取一小段新梢，经消毒后在超净台上用显微操作法取出仅带1-3个叶原基茎尖约1mm大小作穗用采取倒T字形水平切口,嫁接苗用液体滤低桥培养基培养成活率30%50%，嫁接成功植株移植到土壤之前最少要有两片展开真叶,无病毒植物的培养,第39页,苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率,无病毒植物的培养,第40页,苹果不一样取材时期对微体嫁接成功率影响,无病毒植物的培养,第41页,苹果微体嫁接茎尖大小与脱毒成功率,无病毒植物的培养,第42页,试管微体嫁接在果树方面发展最快,(1)嫁接植物不受与珠心及有性实生苗相关幼年阶段影响。

,(2)许多栽培品种经过嫁接繁殖了许多世代，所以果树研究者和种植者关于这些品种自根苗根冠大小、病虫害情况以及耐寒性等了解得极少,无病毒植物的培养,第43页,(3)茎尖组织培养繁殖结合热处理可产生无病毒植物，所以，许多研究者认为对通常采取嫁接繁殖果树进行试管嫁接是很适宜,(4)试管微体嫁接除了可培育无病毒植株外，还可处理难以生根园艺植物生根问题和进行嫁接亲和力研究,无病毒植物的培养,第44页,4,.珠心胚培养脱毒,柑桔类80%以上种类含有多胚性,而单胚占百分比很小,柑橘类植物中有不少多胚品种，一颗种子内除一个合子胚外，还有数个至数十个由珠心细胞形成无性胚，称做,珠心胚,因为,病毒通常是经维管束韧皮组织传输,，而珠心与维管束系统无直接联络由珠心组织诱导产生植株就可免去病素毒危害,无病毒植物的培养,第45页,它与合子胚不一样，不是受精产物，而是由体细胞产生，所以含有和母体相同遗传组成；,与合子胚一样，在珠心胚和植株之间无维管组织连系，所以即使母体植株感染了病毒，珠心胚也是无毒；,在自然条件下，珠心胚普通都不能发育成熟，只有适时从种子中剥离出来，接种在人工培养基上，珠心胚才能长成植株，而这些植株应该是不带病毒母体无性系。

,珠心胚含有3个特征,无病毒植物的培养,第46页,5.花药培养脱毒,花药培养最初目标，是培育起源于花药内部花粉粒单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料起源,但经大量试验表明花药培养所得植株有95%以上是能开花结果多倍体，而且生长发育都优于母株,已证实，经愈伤组织培养出来花药植株是不带病毒，借此方法，不但可快速培育出大量无毒植株，并可省去病毒判定工作，对基层生产应用实为一举两得事情,无病毒植物的培养,第47页,三、分离茎尖培养情况,第一个：,是生长停顿,，接种组织并有扩大，颜色逐步变褐而枯死，这种情况大多是生,长点在分离接种过程中受伤,而造成；,第二种：,是生长太慢,，茎尖接种后颜色逐步变绿，但不见增大，最终成绿色小点这是因为,生长素浓度偏低，或培养温度过低,所造成，假如马上转入较高浓度生长素培养基中，或提升培养温度，即能促进茎尖生长；,无病毒植物的培养,第48页,第三种：,是生长过旺,，接种后茎尖显著增大，约培养一同后即在茎尖基部产生愈伤组织，但不易见到茎尖伸长，组织颜色也较浇这是因为培养茎,生长素浓度偏高，或光照弱，温度高,而造成为此应将培养材料转入生长素浓度较低培养基中，或降低温度，提升光照强度来处理。

不然时间长了愈伤组织会表换生长分化能力；,第四种：,是生长正常,、在营养、激素、温度、光照等各方面条件正常情况下，接种茎尖颜色逐步变绿，基部逐步增大，有时形成少许愈伤组织，茎尖也逐步伸长，培养一个月左右转入无基素基本培养基，茎尖继续伸长，并产生根系，最终发育成完整植株,无病毒植物的培养,第49页,第三节无病毒植株脱毒程序,一、材料准备,1决定植物种类及品种选取生长健壮，遗传性一致品种为材料，并探明该品种除所脱除,病毒在寄主中位置,2了解该植物体内所含有病毒种类及危害程度依据植物所带病毒种类，选择指示植物(敏感植物),3决定脱除病毒方法：“茎尖培养”还是“热处理”还是“微体嫁接”,无病毒植物的培养,第50页,二、生长点分离和培养(茎尖培养为例),1从罹病植株上切取顶芽或腋芽,2材料表面灭菌、决定灭菌药剂、浓度、时间,3依据病毒在寄主内分布位置决定切取茎尖大小假如热处理，那么决定热处理温度、时间,4接种成功率与茎形状结构相关,例马铃薯、百合生长点呈半圆形较大、好分离,番薯、矮牵牛、香石竹呈半圆形，也比很好分离,大丽花、菊花生长点扁平、并被对生叶原基夹住难分离,草莓，叶原基上生有密集茸毛，生长点埋在肉质凹形槽,内，不但难分离且轻易污染。

,无病毒植物的培养,第51页,三、无病毒植物判定,经过茎尖分生组织培养、热处理脱毒法、微体嫁接法而培养成植株，不一定都是无病毒植株,当前用于病毒检测方法有以下3种：,血清判定法；,生物判定法(敏感植物或指示植物)；,电子显微镜判定法,采取单一判定法并不十分可靠尤其是对一些特异性病毒，单一判定方法可靠性更差最好三种方法同时判定，能够取得理想结果,无病毒植物的培养,第52页,(一)指示植物判定法,1、原理,指示植物法是利用病毒在其它植物上产生枯斑作为病毒种类判别标准，也即枯斑和空斑测定法,无病毒植物的培养,第53页,2、指示植物两种类型,一个是接种后产生系统性症状，出现在病毒扩展到植物非接合部位，通常没有局部显著病斑；,另一个是只产生局部病斑，常由坏死、褪绿或环斑组成,惯用指示植物：,千日红、曼陀罗、豇豆、心叶烟、辣椒、莨菪等,,无病毒植物的培养,第54页,每种病毒都有自己敏感植物如：,马铃薯病毒敏感植物：,千日红、黄花烟、心叶烟、毛叶曼陀罗；,大蒜病毒敏感植物：,藜、千日红；,草莓病毒敏感植物：,威州草莓,(从八倍体野生种选出)、,野草莓、野红草莓,等,桃红叶病毒敏感植物：,旱金莲,,大丽花病毒敏感植物：,昆落阿藜、苋色藜、心叶烟、克里芙兰烟、矮牵牛、黄瓜。

,香石竹病毒敏感植物：,昆落阿藜、苋色藜,,菊花病毒敏感植物：矮牵牛、豇豆,无病毒植物的培养,第55页,3、,敏感植物判定病毒方法：,A、摩擦接种法：,取培养植株叶片榨汁，将其汁用摩擦法接种到各自敏感植物上，然后视其病斑有没有，来判断是否脱除了病毒,接种后如若敏感植物叶片表现病斑，可依据病斑类型判断，还有哪种病毒没有脱除,无病毒植物的培养,第56页,例：马铃薯体内各种病毒在其敏感植物上表现症状,：,X病毒侵染千日红(,叶片呈枯斑,)；,M、S病毒侵染千日红(,叶片呈突起枯斑,)；,X病毒侵染黄花烟(,叶片呈花叶,)；,Y病毒侵染黄花烟(,叶片花叶或条斑或呈显著脉绿带,)；,X病毒侵染心叶烟(,叶片呈花叶,)；,Y病毒侵染心叶烟(,叶片呈条斑,)；PG带毒体侵染心叶烟(叶片呈花叶)；,M、Y病毒侵染毛叶曼陀罗(叶片呈枯斑),植物汁液摩擦接种后，如使千日红叶片呈枯斑，使黄花烟、心叶烟叶片呈花叶证实，该植物体内含有马铃薯X病毒,无病毒植物的培养,第57页,B嫁接法：,有些病毒,不是经过汁液传输，而是经过专门介体传输,如草莓黄化病毒、草莓丛枝病毒是经过一个特殊蚜虫为介体进行传输,这种病毒判定，需将培养植株芽嫁接在敏感植物上，依据敏感植物病症表现来判断是否脱除了病毒。

,无病毒植物的培养,第58页,木本多年生植物及草莓等无性繁殖草本植物通常采取嫁接接种方法,以指示植物作砧木，被判定植物作接穗，可采取劈接、靠接、芽接等方法嫁接，其中以劈接法为多,如草莓以对病毒敏感欧洲草莓（野草莓）和深红莓作指示植物，从经脱毒得到植株上仅取成龄叶片顶端一小叶作接穗，叶柄用刀片削成楔形，削面长810 mm，然后快速将接穗小叶叶柄插入切口，用塑料绑缚接合部，嫁接后4周，若带有病毒，则在新展开叶片、匍匐茎或老叶上会出现病征,无病毒植物的培养,第59页,（,二）抗血清判定法,1、,基本原理：,当动物被病毒感染或人工注射异体蛋白质时，在动物体内会产生一个特异性丙种球蛋白称为免疫球蛋白，即所谓“抗体”,引发形成抗体物质(病毒或异体蛋白)称为“抗原”,无病毒植物的培养,第60页,抗原和抗体结合，表现为很强特异性即由一个病毒产生抗体，只能结合该种病毒抗体在特殊细胞内形成，进入血液存在于血清和体液内,这种含有特异性“抗体”血清称为,“抗血清”,抗原和抗体相结合反应称为,“血清反应”,无病毒植物的培养,第61页,2.病毒抗血清在诊疗上价值,,A.病毒抗血清含有高度专化性即由一个病毒产生“抗体”，只能结合该种病毒(抗原)。

如由注射(感染)TMV而产生抗体(免疫球蛋白)，只能检测TMV病毒(才可能发生血清反应),B因为“抗血清”法含有高度专化性，所以对于那些受感染而没有症状带毒植物，也能诊疗，故在实用上含有很高价值,C因为病毒与“抗血清”“反应量”与病毒浓度成正比只要知道其中一个浓度，可依据反应量来测定另一个浓度故此能够用来作病毒定量分析,无病毒植物的培养,第62页,3.病毒抗血清在诊疗上不足：,A.不是全部病毒都能制成抗血清，普通“黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传输病毒如马铃薯卷叶病毒极难或不能取得“抗血清”,B病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备抗原结构,C植物体内含有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质,无病毒植物的培养,第63页,4.方法,抗血清判定首先要进行抗原制备，包含病毒繁殖、病叶研磨、汁液澄清、病毒悬浮液提纯、病毒沉淀等过程只有取得高纯度抗原，才有可能取得高度纯净抗血清,普通采取家兔制备抗植物病毒抗血清，以924个月大小家兔为好，注射病毒悬浮液，在家兔饥饿12 h后采血，再进行抗血清分离和吸收等过程血清可分装在小玻璃瓶中，贮存在1520 冰冻条件下，也能够分装在安瓶中，冷冻干燥，然后密封，有效保留。

,无病毒植物的培养,第64页,详细测定可采取沉淀反应、凝集反应、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和酶联免疫吸附试验等各种方法,无病毒植物的培养,第65页,酶联免疫吸附法,(enzyme 1inked immunOsOrbentassay，EL工SA),酶联免疫吸附法是把抗原抗体免疫反应与酶催化反应相互结合而发展起来一个综合性技术，,它灵敏度高，特异性强，,尤其是当寄主体内病毒浓度很低或同时存在病毒钝化物或抑制剂时，它优势尤为显著，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广一个方法,无病毒植物的培养,第66页,酶联免疫吸附法原理,利用以酶标识特异抗体来指示抗原抗体结合，从而检出样品中抗原,详细操作程序是：,将待检植物汁液(抗原)注入酶联板(聚苯乙烯多孔微量反应板)中，使抗原吸附于它孔壁，然后加入以酶标识特异抗体，待抗原与抗体充分反应后，洗去未与抗原结合多出酶标识抗体，于是在固相载体酶联板表面就只留下以酶标识抗原抗体复合物这时加入酶无色底物，复合物上酶催化底物降解，生成有色产物这一结果可用肉眼识别，也可用分光光度计对底物降解量进行测定,无病毒植物的培养,第67页,血清判定法,无病毒植物的培养,第68页,血清判定基本方法,A.玻璃片凝集法,在清洁玻璃片一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。

然后各加滴被检植物压榨出原汁液两滴用玻璃棒搅匀，在常温下静置20-50min，然后在40-60倍显微镜下观察带病毒叶绿体发生经典凝集现象,无病毒植物的培养,第69页,玻璃片凝集法,无病毒植物的培养,第70页,B微量凝集试验(MAT),在培养皿底部，铺上一层火棉胶或聚乙烯醇缩甲醛薄膜，然后将抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆盖一层石蜡油在2025下保温，20-50min后观察,此法优点：,判定时能够完全防止蒸发，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培养皿能够判定几十个样品对一些病毒(马铃薯M病毒)引发细微病毒凝聚现象均可识别,无病毒植物的培养,第71页,（三）电子显微镜检验法,采取电子显微镜，能够经过直接观察，检验出有没有病毒存在，并能够得知相关病毒颗粒大小、形状和结构,又能够判定病毒种类这是一个较为先进方法，但需一定设备和技术,,病毒,形态长(nm)宽（nm）,X 线状 515 13,Y 线状 730 11,A 线状 730 11,S 线状 650 1213,M 线状 650 1213,无病毒植物的培养,第72页,灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒,当前利用负染和超薄切片电镜观察能够诊疗和判别病毒到属水平。

,1973年，Derrick把电镜与免疫学技术相结合，建立了更为灵敏免疫吸附电镜技术，该技术已成为植物病毒研究一个主要伎俩,方法优点,无病毒植物的培养,第73页,(四)分子生物学方法,在植物病毒判定中采取分子生物学方法主要是检测病毒核酸,普通都含有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点,核酸杂交技术原理:,采取带有放射性或非放射性物质标识已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下与靶病毒核酸单链退火形成杂交双链经过杂交信号检测，判定样本中有没有对应病毒基因,无病毒植物的培养,第74页,19世纪末以来，许多国家开始用聚合酶链式反应(PCR)技术检测果树病毒，并取得很好效果,惯用有聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，,即利用已知病毒核苷酸序列或同组病毒相同序列区域来设计引物，将待测样品用PCR技术体外扩增DNA，扩增后产物可进行限制性片段长度多态性,(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA RAPD)、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing grade gel electrophoresis，DGGE)、单链构象多态性(single-strandconformation polymorphism，SSCP)、探针交叉杂交等技术分析检测病毒是否存在。

,无病毒植物的培养,第75页,因为多数植物病毒核酸是RNA，在进行PCR检测前，需以RNA为模板，经逆转录生成cDNA后，再利用病毒核酸特有序列设计引物进行PCR反应，即可知道在寄主中是否有病毒存在,RNA病毒和类病毒等在寄主体内可形成双链RNA(dsRNA)，而普通情况下植物体内不存在dsRNA，所以dsRNA分析也可用于植物病毒判定,无病毒植物的培养,第76页,利用DNA杂交和荧光标识技术相结合基因芯片技术也是植物病毒快速检测主要发展方向,在实际应用中，为了提升检测可靠性，往往用几个方法同时判定最终选择出无毒苗即可进行扩增繁殖，用于生产但在无毒种苗扩增繁殖和应用过程中应注意预防再度感染,无病毒植物的培养,第77页,无病毒植物的培养,第78页,植物脱毒苗生产应用尚不普遍，原因以下：,基础研究跟不上，诸如病毒特征与寄主关系，各植物种体内都有什么病毒等,脱毒培养后怎样快速检测,得到脱毒原种苗后，怎样保留?怎样预防再度侵染等,无病毒植物的培养,第79页,四、无毒原种苗繁殖,经茎尖培养法，热处理法、微体嫁接法取得无病毒株数量是很有限，需扩大繁殖才能满足生产需要,首先充分发挥组织培养作用，在室内加速繁殖；另首先加速田间繁殖。

,与此同时对脱毒株系进行植物学性状判定，遗传稳定性判定，并依据病毒判定结果，淘汰有毒株系，保留性状优良无毒株系,无病毒植物的培养,第80页,五、无毒原种保留,无毒植株并不含有额外抗病性，它们有可能很快又被重新感染为了处理这个问题，应将,无毒原种种在温室或防虫罩内灭过菌土壤中,在大规模繁殖这些植物时候，应把它们,种在田间隔离区内,，其中应极少有或完全没有重新感染机会,另外一个更轻易也是更廉价方法，是把由,茎尖得到并已经过脱毒检验植物经过离体培养进行繁殖,无病毒植物的培养,第81页,六、脱毒植株应用,在研究特定病毒对寄主植物影响时，无毒植株是非常有用试验材料,更主要是，主要是经过茎尖培养所得到无毒植株发育情况表明，很多病毒能在寄主植物中造成生活力、品质和产量严重损失,经过把已知病毒引入无毒植株，并比较同一个无性系感病株和无毒株表现，能够对病毒造成产量损失做出更准确预计,无病毒植物的培养,第82页,经过茎尖培养方法，Stone(1973)由个品种水仙中取得了一个无阿拉伯花叶病毒和水仙退化病毒无性系,这种无毒鳞茎比普通原种长得快，生活力强，比受侵染植株花大，颜色丰富，每个茎花多大黄脱毒后叶柄产量增加了6090。

,天竺葵很多品种带有不表现症状病毒据报道，由其茎尖培养产生植株比未受过处理植株生活力强，产生插条数目多20一30，而且这些插条很轻易生根,无病毒植物的培养,第83页,七、病毒以外病原菌离体消除方法,茎尖培养和愈伤组织培养主要用于消除病毒，但有些证据表明，也可经过培养消除其它病原菌如类菌质体、细菌和真菌,jacoli(1978)指出，胡萝卜外植体经过重复转管后，其中感染星黄菌(类菌质体状小体)逐步退化并在80d内消失,无病毒植物的培养,第84页,培养植物组织内带有细菌和真菌，因为在培养基上增殖很快，在普通情况下很轻易表现出来,经过茎尖培养已经在花叶,万年青和天竺葵,中消除了这类周身侵染,细菌,,在,康乃馨,中已经消除了由,蔷薇镰孢霉,引发茎腐病,无病毒植物的培养,第85页,无毒种苗在实际应用中问题是再度感染，怎样预防再度感染，必须建立一个体系,在这种体系中应做到：,研究、繁殖、生产严格分工,原原种和原种繁殖，必须在隔离网室中进行；良种繁殖，可采取集团隔离即在无毒源和其它病虫害大田中进行良种提供农家生产，经23年后再度感染，可全部更新,无病毒植物的培养,第86页,。