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无病毒植物的培养教程.ppt 全文免费

花匠小妙招
2024-11-19 06:34

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 3.病毒抗血清在诊断上的局限性： A.不是所有病毒都能制成抗血清，一般“黄化型”病毒，或严格由专化性昆虫传播的病毒。如马铃薯卷叶病毒极难或不能获得“抗血清”。 B．病毒在寄主体内含量太少，而提纯过程中丧失又太多。或者提纯过程中，病毒质粒丧失了必备的抗原结构。 C．植物体内具有单宁物质，单宁与病毒结合，使病毒丧失了抗原性质。 4.方法抗血清鉴定首先要进行抗原的制备，包括病毒的繁殖、病叶研磨、汁液的澄清、病毒悬浮液的提纯、病毒的沉淀等过程。只有获得高纯度的抗原，才有可能获得高度纯净的抗血清。一般采用家兔制备抗植物病毒的抗血清，以9~24个月大小的家兔为好，注射病毒悬浮液，在家兔饥饿12 h后采血，再进行抗血清的分离和吸收等过程。血清可分装在小玻璃瓶中，贮存在－15~－20 ℃的冰冻条件下，也可以分装在安瓶中，冷冻干燥，然后密封，有效保存。具体测定可采用沉淀反应、凝集反应、免疫扩散、免疫电泳、荧光抗体技术和酶联免疫吸附试验等多种方法。酶联免疫吸附法 (enzyme 1inked immunOsOrbentassay，EL工SA) 酶联免疫吸附法是把抗原—抗体的免疫反应与酶的催化反应相互结合而发展起来的一种综合性技术，它的灵敏度高，特异性强，特别是当寄主体内病毒浓度很低或同时存在病毒钝化物或抑制剂时，它的优势尤为明显，因而是近年来病毒检测方法中发展最快、应用最广的一种方法。酶联免疫吸附法的原理利用以酶标记的特异抗体来指示抗原—抗体的结合，从而检出样品中的抗原。具体操作程序是：将待检植物汁液(抗原)注入酶联板(聚苯乙烯多孔微量反应板)中，使抗原吸附于它的孔壁，然后加入以酶标记的特异抗体，待抗原与抗体充分反应后，洗去未与抗原结合的多余酶标记抗体，于是在固相载体酶联板表面就只留下以酶标记的抗原—抗体复合物。这时加入酶的无色底物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色产物。这一结果可用肉眼识别，也可用分光光度计对底物的降解量进行测定。血清鉴定法血清鉴定的基本方法 A.玻璃片凝集法在清洁玻璃片的一端，用毛细管滴加5滴稀“抗血清”，另一端滴加等量对照血清。然后各加滴被检植物压榨出的原汁液两滴。用玻璃棒搅匀，在常温下静置20-50min，然后在40-60倍显微镜下观察。带病毒的叶绿体发生典型的凝集现象。玻璃片凝集法 B．微量凝集试验(MAT) 在培养皿底部，铺上一层火棉胶或聚乙烯醇缩甲醛薄膜，然后将抗血清滴入薄膜上，再在血清液滴上方覆盖一层石蜡油。在20—25℃下保温，20-50min后观察。此法优点：鉴定时可以完全避免蒸发，抗血清用量少，每毫升抗血清可滴加150次，每培养皿可以鉴定几十个样品。对某些病毒(马铃薯M病毒)引起的细微病毒凝聚现象均可识别。（三）　电子显微镜检查法采用电子显微镜，可以通过直接观察，检查出有无病毒存在，并可以得知有关病毒颗粒的大小、形状和结构,又可以鉴定病毒的种类。这是一种较为先进的方法，但需一定的设备和技术。。病毒形态长(nm) 宽（nm） X 线状 515 13 Y 线状 730 11 A 线状 730 11 S 线状 650 12~13 M 线状 650 12~13 灵敏度高和能在植物粗提取液中定量测定病毒。目前运用负染和超薄切片电镜观察能够诊断和鉴别病毒到属的水平。 1973年，Derrick把电镜与免疫学技术相结合，建立了更为灵敏的免疫吸附电镜技术，该技术已成为植物病毒研究的一个重要手段。方法的优点 (四)分子生物学方法在植物病毒鉴定中采用的分子生物学方法主要是检测病毒的核酸。一般都具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等特点。核酸杂交技术的原理:采用带有放射性或非放射性物质标记的已知序列核酸单