首页 > 分享 > 一种月季小热激蛋白基因RcHsp20

一种月季小热激蛋白基因RcHsp20

花匠小妙招
2026-04-19 08:07

中的应用技术领域

[0001]本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种月季RcHsp20‑6基因在调控花器官数量中的应用。

背景技术

[0002]月季（Rosa chinensis）是蔷薇科蔷薇属的多年生常绿或落叶灌木。花型是观赏植物重要的观赏性状。因此，花型多样性是月季育种的一项重要目标。花型发育的核心是花器官数目与形态的调控，目前，对月季花型的分子机理研究主要集中在花发育ABCDE模型上的基因，而热激蛋白调控花器官数量的分子机理研究鲜有报道。因此，本研究提供了一种月季RcHsp20‑6基因，具有影响花器官数量的作用，为今后探索热激蛋白参与花型分子育种实验提供了理论指导和基因储备，以期多元解析花型多样性的分子机理。

[0003]热激蛋白Hsp20的分子量在15 42 kDa之间，又叫小热激蛋白。作为一种重要的分子伴侣，小热激蛋白Hsp20普遍存在于所有生物体内。Hsp20蛋白在植物生长发育以及响应包括高温在内的多种环境胁迫的过程中具有非常重要的作用。目前，对Hsp20蛋白的研究主要集中在生物和非生物胁迫的响应上，其参与花器官数量的调控功能并未深入研究。

发明内容

[0004]本发明的目的在于提供一种RcHsp20‑6基因的克隆方法、载体构建及其在花器官数量调控上的应用。

[0005]本发明的目的之一在于提供一种RcHsp20‑6基因及其编码的蛋白。该基因ORF区为474 bp，编码157个氨基酸。

[0006]本发明的目的之二在于提供上RcHsp20‑6基因的表达蛋白，该蛋白属于CⅡ亚家族。

[0007]本发明的目的之三在于获得含有RcHsp20‑6基因的拟南芥转化植株。

[0008]本发明的目的之四在于提供上述RcHsp20‑6基因在调控花器官数量中的应用。

[0009]本发明的目的将通过以下技术方案实现：

[0010]本发明所述的RcHsp20‑6基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

[0011]本发明所述的RcHsp20‑6基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0012]本发明含有所述的RcHsp20‑6基因的重组表达载体或重组菌。

[0013]所使用的过表达载体为pCAMBIA1300‑GFP载体，将上述基因序列插入到pCAMBIA1300‑GFP载体的多克隆位点BamH Ⅰ和Sal Ⅰ之间，改造得到相应的重组表达载体。

[0014]构建所述的RcHsp20‑6基因的过表达载体，并将其通过稳定遗传转化的方式转化到模式植物拟南芥中，应用于花器官数量的调控作用，筛选获得花瓣和雄蕊数量发生改变的植物。

[0015]所述模式植物为拟南芥。

[0016]本发明采用的是浸花法侵染拟南芥，并获得转基因植株。

[0017]本发明对比转RcHsp20‑6基因拟南芥与野生型拟南芥的花器官数量。

[0018]相比于现有技术，本发明的有益效果为：

[0019]本发明基于植物基因克隆技术，从月季品种‘玉玲珑’中分离、克隆出RcHsp20‑6基因，在此基础上构建了过表达载体并转化到模式植物拟南芥中，获得高表达的转基因植株，筛选至T3代，通过体式显微镜观察拟南芥不同花器官数量，发现转RcHsp20‑6基因的植株的部分花中花瓣数量和雄蕊数量发生变化，出现以下几种表型：花瓣数量增加，雄蕊数量不变或减少；花瓣数量不变雄蕊数量减少。说明RcHsp20‑6基因具有调控花器官数量的功能，可能是影响月季花器官数量的潜在基因。

附图说明

[0020]图1为本发明提供的RcHsp20‑6基因编码蛋白与其他物种HSP20家族蛋白的系统发育进化树。

[0021]图2是RcHsp20‑6基因的克隆琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道M为DL 2000plus marker，泳道1、2为RcHsp20‑6基因克隆PCR结果。

[0022]图3是转基因拟南芥土培法阳性苗筛选图。

[0023]图4是转基因拟南芥的PCR鉴定电泳图，其中M为DL 2000plus marker，泳道1为空载对照，泳道2‑6为5个转基因拟南芥株系。

[0024]图5是野生型和转RcHsp20‑6基因拟南芥的花器官表型变化图，其中EV为转p CAMBIA1300‑GFP空载，OE1、OE2、OE3为转基因。

具体实施方式

[0025]通过以下详细说明可以对本发明进一步进行描述。所提供的实施例仅用以解释本发明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0026]实施例1：月季RcHsp20‑6基因克隆

[0027]采用FastPure Universal Plant Total RNA Isolation Kit（Vazyme，中国南京）试剂盒提取‘玉玲珑’总RNA，以提取的总RNA为模板，通过HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)（Vazyme，中国南京）试剂盒反转录为cDNA。

[0028]利用Primer 5设计RcHsp20‑6基因克隆特异性引物，以上述得到的cDNA稀释10倍为模板，按照以下反应扩增出RcHsp20‑6基因的ORF区，特异性引物序列如下：

[0029]RcHsp20‑6‑F1:5’‑ ATGGATTTCAGAATCATGGGTCTG‑3’

[0030]RcHsp20‑6‑R1:5’‑ CTAACCAATCTTGACCTCAATAGTC‑3’

[0031]目的基因片段进行PCR克隆，50μL反应体系如下：

[0032]1 μL模板cDNA，5 μL dNTP (2mM)，5 μL 10×PCR Buffer for KOD，3 μL MgCl (25 mM)，上下游引物各2 μL，1 μL KOD‑Plus‑Neo (1 U/μl)和31 μL ddHO。

[0033]加样操作在冰上进行，加样完成后混匀并使用2500 rpm低速离心，按以下程序放置于PCR仪进行扩增反应：

[0034]95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，循环35次；72 ℃ 10 min。

[0035]经PCR反应得到扩增产物(图1)，用1％的琼脂糖凝胶电泳(140V，12min)检测，在凝胶成像系统中观察条带情况。

[0036]将跑完胶的胶块放置于紫外透射仪下，切下符合目的基因序列长度的条带，使用胶回收试剂盒（OMEGA）按照说明书回收纯化目的条带。

[0037]将4 μL胶回收产物连接至1 μL 5 min TA/Blunt‑Zero Cloning Kit（Vazyme，中国南京）载体，将反应液轻柔吸打几次后使用PCR仪控温反应，条件为：37 ℃，5 min。

[0038]将上述连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞（上海唯地），具体的操作步骤如下：

[0039]将大肠杆菌DH5α感受态冰浴融化（处于冰水混合物状态时转化效率最高）；

[0040]感受态融化后，将5 μL连接产物加入50 μL感受态中，轻柔拨打离心管混匀，冰浴25 min；

[0041]42 ℃水浴热激45 s，立即置于冰浴2 min；

[0042]加入提前37 ℃预热的LB液体培养基700 μL，放入振荡培养箱中，37 ℃，200 rpm振荡培养大肠杆菌1‑1.5 h；

[0043]5000 rpm，1 min离心菌液，弃掉上清液，保留100 μL左右的浓缩菌液，涂布于含有100 mg/L Amp的LB平板培养基，37 ℃倒置培养12‑14 h(倒置)。

[0044]当培养基上长出菌后，在LB固体平板上挑选阳性克隆10‑20个单克隆菌株于30 μL LB液体培养基的离心管中，37 ℃，200 rpm，振荡培养1 h；然后以振荡培养的菌液为模板，以载体配套的通用引物M13F和M13R为检测引物，按照下列反应体系配制PCR反应液，验证插入目的基因大小。

[0045]10 μL反应体系：包括1 μL菌液模板，3 μL ddHO，上下游M13引物各0.5 μL，5 μL Es‑Taq Master Mix。

[0046]PCR反应条件为：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，循环30次；72 ℃ 10 min。

[0047]PCR结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测，保留与目的条带长度一致的菌液，吸取200‑500 μL的菌液送去生物公司测序，得到测序结果后，使用DNAMAN软件将测序结果与原序列进行比对，并将剩余序列正确的菌液取300 µL与等量的60%甘油混匀储存在‑80 ℃冰箱备用，同时吸取200 µL左右的菌液加入10 ml的液体LB培养基过夜摇菌，增殖大肠杆菌单位体积数量，之后使用质粒提取试剂盒提取质粒备用。

[0048]质粒提取的具体操作步骤参照质粒提取试剂盒(TIANGEN，中国)说明书。

[0049]实施例2：月季RcHsp20‑6基因的植物过表达载体的构建

[0050]利用同源重组的方法，将去掉终止密码子的月季RcHsp20‑6基因ORF区构建到植物表达载体GV1300的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到重组植物表达载体GV1300‑RcHsp20‑6‑GFP。载体构建使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(诺唯赞,中国)同源重组试剂盒，按照说明书进行，载体同源臂序列的特异性引物(下划线部分为BamH I和Sal I酶切位点)如下：

[0051]RcHsp20‑6‑BamH Ⅰ‑F：5’‑ttgatacatatgcccgtcgacATGGATTTCAGAATCATGGGTCTG‑3’

[0052]RcHsp20‑6‑Sal Ⅰ‑R：5’‑gcccttgctcaccatggatccACCAATCTTGACCTCAATAGTCTTGG‑3’

[0053]将重组后的载体转大肠杆菌测序，涂板经Kana筛选后利用菌液PCR验证（图2），引物为载体通用引物，将条带正确的菌液送至生物公司测序，测序结果与目标序列一致。

[0054]实施方案3：月季RcHsp20‑6基因遗传转化拟南芥

[0055]通过冻转法将重组质粒GV1300‑RcHsp20‑6‑GFP转入到根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，转化步骤参照说明书。

[0056]采用浸花法将转化重组质粒GV1300‑RcHsp20‑6‑GFP植物过表达载体的农杆菌遗传转化拟南芥，具体方法如下：

[0057]拟南芥播种：在超净工作台中，将野生型拟南芥种子用75％酒精消毒2min，重复一次，随后用无菌水振荡清洗3～5次，再用0.8%的次氯酸钠溶液浸泡10min，随后用无菌水振荡清洗3～5次，吸净菌体，将消毒完成的种子点播在1/2MS固体培养基上，置于4℃春化3天后放置于组培室中培养7～10天，待拟南芥长出4片子叶时，移出培养基，将其移栽于土壤中。待拟南芥第一次抽薹后将其主花序剪除，以便诱导更多次级花序抽薹，从而获得更多花序以便增加侵染效率。栽培基质配方为泥炭土：蛭石：珍珠岩按 5：3：2 比例混合而成，且经过高温灭菌；培养室条件：温度20‑22℃，16 h 光照/8 h 黑暗，光照强度为10000lux，相对湿度为70％。

[0058]侵染液的制备：将带有重组质粒的农杆菌加入至50 mL含有50 mg/L Kana和30 mg/L Rif的液体YEP中，28 ℃，200 rpm振荡培养至OD 值达到0.8‑1.0，离心收集菌体，用悬浮液重悬菌体，调至OD＝0.8‑1.0，黑暗静置1h，即为最终侵染液；

[0059]将正在开花状态的拟南芥剪去果荚，将其花序浸泡在侵染液中侵染2min，侵染结束后将拟南芥植株放在暗环境下24h，随后放于正常培养箱中培养，一周后再重复侵染一次。待拟南芥种子成熟后，收取种子放于37℃烘箱中烘干。

[0060]实施方案4：转基因拟南芥阳性苗筛选与鉴定

[0061]将春化后的T0代种子均匀地撒在土壤表面，保持土壤湿润，然后盖上透明塑料膜，待种子萌发后，揭开保鲜膜，待种子发芽一周后，喷施300 mg/L潮霉素，每隔一天喷一次，初步筛选拟南芥阳性苗。当拟南芥抽薹时取0.1g叶片采用CTAB法提取DNA，使用3.2.3中设计的特异性引物以提取的拟南芥叶片DNA为模板进行PCR反应来鉴定拟南芥转基因株系。用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，将含有目的基因的PCR扩增产物进行测序，序列无误后则为鉴定的阳性苗为T1代转基因株系拟南芥。并分株进行回收转基因苗种子，直至培养至T3代，以此用于后续表型观察和表达分析。

[0062]实施例5：T3代转基因拟南芥花器官表型观察

[0063]为探究月季RcHsp20‑6基因对拟南芥花发育的影响，观察转基因拟南芥花器官数量的变化。发现转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，部分花花瓣对称性发生变化，花器官出现以下几种表型：花瓣数量增加，雄蕊数量不变或减少；花瓣数量不变雄蕊数量减少（图5）。