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荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens RN

花匠小妙招
2026-05-10 14:02

0 引言

桃褐腐病又称实腐病或菌核病[1]，主要由半知菌亚门美澳型核果链核盘菌(Monilia fructicola)引起[2]。该病原菌是一种多环性病原菌，其侵染序列在寄主的整个年生长周期中重复多次[3]，可导致枝条和叶片枯死、花朵腐烂、果实出现病斑及脱落等现象[4-5]，特别是采收前的成熟期是发病的高峰期，导致果实丧失商品价值，严重制约着桃产业的发展[6]。传统用于桃褐腐病害防治的方法是使用化学合成农药，如苯甲嘧菌酯、甲基硫菌灵、稀唑醇、代森锰锌等药物[6-7]，但这些化学制剂的农药往往会在植物果实产品或土壤中残留，给生态和食品安全带来新问题[8-9]。同时，长期地使用农药也导致病原菌对农药的耐药性逐渐增强，使化学防治效果降低，而且施药后的清理成本也增加，不利于农业的可持续发展[4⇓⇓-7]。生物农药因其无毒、叶片无残留、无抗药性，成为了综合治理桃褐腐病的重要途径[1]。有研究表明，生物农药可以平衡微生物群落，控制土壤传播病害，提高作物产量，并且不易产生抗药性[10⇓⇓-13]。因此，研发和应用无污染、无害生防菌株，对桃褐腐病的防治有重要的实践意义[14]。

假单胞菌属(Pseudomonas)是研究最多的植物促生菌[15]。其中，荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌等通过根瘤定植、抗生物和铁螯合物的生产来抑制土传病原体[16]。作为一种有效的生防菌，荧光假单胞菌主要通过产生吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxyl acid, PCA)和2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol，DAPG)等抗生素、产生挥发性化合物、分泌噬铁素等与铁、磷等元素的竞争、竞争营养和空间位点以及诱导系统抗性等方式在植物病害中得到广泛研究[17⇓⇓⇓⇓-22]。然而，关于其作为生防制剂在果树病害中应用潜力的研究或报道较少，尤其是关于假单胞菌代谢产物在环境中应用的稳定性也鲜有报道。因此，进一步的研究和评估荧光假单胞菌作为果树病害生防制剂的效果以及其代谢产物在实际环境中的稳定性是非常重要的。目前关于桃褐腐病生物防治的报道较少，本实验室前期从北京的农田土壤中筛选得到了103株高效广谱拮抗细菌[23]，其中Pseudomonas fluorescens RN-88对桃褐腐病菌的抑制率较高。因此本研究的主要目的：（1）研究该菌的发酵液的抑菌活性；（2）研究其发酵液的抑菌活性在不同环境中的稳定性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株为拮抗细菌RN-88，由本实验室筛选分离获得并保存，经前期的研究鉴定为荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens RN-88)[23]；植物病菌：Monilinia. fructicol，链核盘菌属真菌，由本实验室保存并提供。

供试培养基分别为LB固体培养基：5 g/L酵母粉，10 g/L氯化钠，10 g/L胰蛋白胨，12 g/L琼脂；发酵培养基(LB液体培养基)：5 g/L酵母，10 g/L氯化钠，10 g/L胰蛋白胨，用于细菌培养；PDA固体培养基：200 g/L土豆浸提液，17 g/L蔗糖，10 g/L琼脂。用10% NaOH调pH至7.0，用于真菌培养。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵液的制备

将在LB固体培养基上的细菌RN-88活化后接入LB液体培养基中，在37℃，180 r/min条件下恒温振荡培养24 h[24]。

1.2.2 抑菌活性的测定

培养结束后，测定细菌发酵液对M.fructicol的抑制活性，通过滤膜过滤(0.22 μm)、高温灭菌)(121℃，20 min)两种方式获得无菌发酵液，对比2种除菌方式下发酵液抑制真菌活性。装置使用杯碟法[13]：在含有10%处理液的PDA固体培养基上培养M. fructicol。接种3 d后，通过测量真菌生长直径，记录2种处理对桃褐腐真菌抑制效果，以接种M. fructicol但不加发酵液的处理为对照，试验设置3组重复。

抑菌率的计算见公式(1)。

(1)

其中dcontrol：对照平板中真菌直径(mm)；dtreatment：试验处理平板中真菌生长直径(mm)。

1.2.3 环境稳定性

设计单因素实验，分别测定发酵液在不同pH，温度以及不同紫外照射时间下抑菌物质的稳定性。pH稳定性测定：用HCl或者NaOH将发酵液分别调成pH 3.0、4.5、5.5、6.5、7.5、8.0、9.0静置2 h，后调回中性pH，然后同2.2.4的方法测定不同发酵液的抑菌活性，以未改变pH 7的发酵液为抑菌活性的对照；温度稳定性测定：将发酵液分别存在于0℃，20℃，30℃，40℃，50℃中恒温2 h后，同2.2.4的方法测定抑菌活性，以室温条件下(25℃)的发酵液为对照；紫外稳定性测定：将发酵液暴露于紫外线下(λ = 250 nm，5 mJ/m2)，分别放置15 min、30 min、1 h、2 h、4 h，测定不同时长紫外线下抑菌物质的稳定性，以未照射紫外线的发酵菌液处理为对照。

1.2.4 数据处理

使用DPS软件进行数据的统计分析与计算，并使用ANOVA进行多重比较，Duncan检验差异显著性，Sigmaplot 12.5画图。

2 结果与分析

2.1 不同灭活方式发酵液的抑菌活性

通过比较滤膜除菌和高温灭菌两种方式发现：滤膜过滤法抑菌效果更为明显（表1）。

表1 不同灭菌处理后发酵液的抑菌率 处理真菌菌落直径/mm 抑菌率/% 对照 46.75 ± 0.33 - 滤膜除菌 25.50 ± 5.69 44.69 (a) 高温灭菌 34.52 ± 5.78 25.96 (b)注：括号中的小写字母表示处理间的显著性(P<0.05)。

经过滤膜过滤后，发酵液的抑菌率为45.36%。然而，高温灭菌后，发酵液的抑菌率只有25.96%，显著低于滤膜除菌的效果。这说明高温灭菌后发酵液中抑菌物质的损失较大。因此相比于高温灭菌而言，滤膜除菌对发酵液的影响较小。基于这个结果，我们选择滤膜法进行后续相关试验。

2.2 发酵液的pH稳定性

在中性及碱性中的发酵液(7.5≤pH≤9.0)，加入培养基后真菌的生长菌落为34.17~38.60 mm，与对照处理中真菌的生长能力相当(36.97 ± 3.82 mm)，说明抑菌活性在中性至碱性环境中变化不大，具有较高的稳定性（图1）；但生防细菌发酵液在酸性溶液(3.0≤pH≤6.5)中处理后，其抑菌能力减弱，桃腐真菌的生长能力增强，菌落直径达(44.93~47.23 mm)，显著高于对照，说明酸性溶液中发酵液的抑菌活性下降，对真菌的抑制作用降低（图1）。

图1 不同pH下发酵液抑菌活性的稳定性

误差线上方不同的小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)

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2.3 发酵液中抑菌成分的温度稳定性

在实验中，对RN-88发酵液施加不同温度(0~50℃)处理，并与对照组进行比较后，证明真菌的生长情况没有明显的改变（图2），其菌落直径分布在34.00~41.83 mm之间。经统计分析后发现，放置在不同温度下时，RN-88发酵液的抑菌活性没有明显的变化。这说明发酵液中的抑菌活性物质具有较好的温度稳定性，在不同的温度下保持较高的活力，并对桃褐腐菌(M. fructicol)有良好的抑制作用，因此该菌的发酵液可用于不同桃树种植区域褐腐病的防治。

图2 不同温度下发酵液抑菌活性的稳定性

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2.4 发酵液中抑菌活性紫外线稳定性

将RN-88发酵液在用紫外照射一段时间后，测定其生长情况。结果显示，添加未经紫外照射的发酵液时，真菌菌落的直径为40.90 ± 0.67 mm，而加入紫外照射后的发酵液时，真菌的菌落直径略有增加，直径范围41.6 ~ 45.9 mm，但经统计分析后发现，并不显著。即使将发酵液在紫外线下暴露2 h(45.90 ± 8.35 mm)，其对真菌生长量的影响与对照相比无显著差异（表2，图3），说明抑菌活性物质对紫外线照射有较高的稳定性。

表2 紫外线处理后发酵液的抑菌率 UV处理时间/min 真菌菌落直径/mm 对照 40.90 ± 0.67 (ab) 15 41.63 ± 1.64 (a) 30 45.72 ± 2.39 (a) 60 43.00 ± 0.23 (a) 120 45.90 ± 8.35 (a)注：括号中的小写字母表示处理间的显著性(P<0.05)。

图3 UV处理后发酵液的抑菌能力

图中左边皿为对照（添加原发酵液），右边皿为处理试验（添加紫外照射后的发酵液）

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3 讨论

与化学农药相比，生物防治是一种更安全、更环保的控制果蔬病害的方法[25]。拮抗微生物（包括酵母菌、酵母样真菌和细菌）的生物防治是预防采前和采后真菌腐烂的一种有前途的工具[26]。近年来，越来越多的研究者将研究重点放在使用生物防治剂来代替化学杀菌剂上[4,9,27]。用于生物防治的细菌众多，包括芽孢杆菌、假单孢菌、生物放射杆菌、黄单胞菌属等[11,28]。特别是假单胞菌，作为一种重要的生物防治资源，主要存在于土壤、植物的根与叶周围。本研究筛选得到的荧光假单胞菌可用于桃褐腐病的防治。荧光假单胞菌是一种非致病性根围细菌，是对抗土传植物病原菌最有效的生物防治剂之一[29]，在多种作物和病原菌互作中，如在纹枯病、纹枯病、稻瘟病和白叶枯病中，荧光假单胞菌已经证明具有抗病和促进植物生长的潜力[30⇓-32]。此外，研究还报道了荧光假单胞菌在小麦全蚀病、棉花幼苗猝倒病、马铃薯软腐病等方面的应用[33-34]。荧光假单胞菌具有广谱的抗菌能力和多种应用环境。除此以外，荧光假单胞菌还可以用于环境中有机污染物的降解[35]，降低污染物对农田土壤的风险，是一种具有潜力的生物防治菌种资源。荧光假单胞菌是一个重要的细菌群体，有助于诱导系统抗性。荧光假单胞菌也参与控制病原体，并形成有机农业的一个组成部分[36]。荧光假单胞菌在自然水体、土壤、叶片和果实表面普遍存在，表明其不太可能对人体健康构成额外风险。然而，在使用该菌株作为生防制剂之前，需要设计和进行严格和进一步的毒性研究[22]。

荧光假单胞菌的发酵液中成分复杂，存在多种抑菌机理。有研究者发现荧光假单胞菌可分泌多种抗菌素和抗菌的次生代谢产物抑制真菌生长主，如硝化吡咯素(Pyrrolnitrin)、氨基粘液菌素(Viscosinamide)、间苯二酚(Resorcinol)、氰化氢(hydrogen cyanide)、多聚乙酰(Polyketides)、藤黄绿脓菌素(yolutorin)等抗菌素类化合物[11,19]；在细菌的胞外分泌物中，包含许多酶类物质，如几丁质酶(Chitinase)、明胶酶(Gelatinase)、蛋白酶(protease)等[11,35]，这些酶可以通过破坏真菌细胞结构而影响其生长。荧光假单胞菌还能分泌表面活性剂类的物质，通过改变病源孢子的表面张力，使孢子细菌破裂而死亡[37-38]。除此之外，相关研究表明，荧光假单胞菌还能产生特定的氨基酸和其他生长促进剂，促进植物生长[36]。在植物保护中，通过植物根际促生菌激活防御基因是一种新的策略[29]。一些菌株通过加强表皮和皮层细胞壁，在侵染部位以外沉积新形成的屏障，包括胼胝质、木质素和酚类物质，并激活编码几丁质酶、POX、PPO和PAL的防御基因来保护植物免受病原菌的攻击[39]。尽管荧光假单胞菌在农业中的应用已得到广泛研究[40]，但其作为生防防治剂在果树病害防控中的潜力研究相对较少，尤其是在桃树果实上的应用。因此，仍需要进一步的研究来评估荧光假单胞菌作为生物防治剂在果树病害防控中的应用前景。高温条件下发酵液中抑菌活性的降低，这有可能是发酵液中的抑菌成分在失活导致的，比如抑菌物质为酶类或抗生素的物质，在高温灭菌的过程中，酶的结构会发生改变，增加β-折叠，而使得酶的活性降低或丧失[41]；杜颐林等[42]同样发现高温会明显降低生防菌的抑菌率。抑菌成分也可能是抗生素类的物质，高温会使抗生素类的物质失活，从而降低了对真菌的抑制能力。菌株RN-88的发酵液活性成分对温度有较强的耐受性，放置在不同温度下时，发酵液的抑菌活性没有明显的改变；紫外线对抗生素具有降解作用[43]。任兴波等[44]从生防菌中发现了对温度和紫外线稳定性均较好的活性物质。本实验中，发酵液在经紫外照射后对真菌生长量的影响与对照相比无显著差异，并且过滤除菌通常是在室温自然条件下进行，温度的改变较小，没有紫外线的影响，对抑菌酶活性的影响不大，在后续实验中可继续采用。

与温度对发酵液条件改变类似，pH往往影响生物质分子的活性，如酶类。有研究表明，中性环境最有利于该活性物质发挥拮抗作用[45-46]。本实验中，在酸性pH下，真菌的生长量与单纯接种真菌的处理（表2）相当，说明抑菌成分几乎完全失活，降低了对真菌的抑制作用，而使得真菌生长显著增强，酸性条件对抑菌活性的改变较大。由此推测，发酵液中的抑菌活性成分可能主要为酶类的生物质分子，通过破坏病源菌的菌丝细胞，抑制其生长[6,42]；但在碱性环境中，发酵液对真菌生长抑制明显，与发酵原液对真菌的抑制活性相当，说明在碱性环境中具有耐受性。在今后的实际应用中，建议在中性到碱性环境中使用该菌的发酵液进行植物病害的防治，同时应当密切注意环境pH的变化，防止抑菌活性的降低或丧失。

4 结论

RN-88发酵液抑菌活性可能受到多种环境因素的影响，结果显示，RN-88拮抗细菌发酵液受温度、UV影响较小，说明该发酵液具有一定的环境适应性，能够在较大地域范围内使用。本研究为该菌种在桃褐腐病中的实际应用提供了理论依据、奠定了良好的基础。尽管本研究对RN-88的抑菌活性及环境稳定性进行了研究，但是对于发酵液中的抑菌活性成份尚不明确，在今后的研究中，可以将该发酵液进行分离纯化，进一步探索其抑菌的机理，同时优化发酵条件，降低生产成本，更好地挖掘RN-88的抑菌能力，促进其在实际应用中的推广。

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