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抗病相关基因在黄瓜和甜瓜中的遗传转化及功能初步分析

花匠小妙招
2024-11-07 00:34

摘要

黄瓜(Cucumis sativus L.)和甜瓜(Cucumis melon L.)是经济价值很高的瓜类作物,在国内乃至世界范围内栽培面积较大。病害的发生给黄瓜和甜瓜的生产带来了巨大损失,严重制约了黄瓜、甜瓜的产量和品质的提高。
　　植物基因工程技术的快速发展为瓜类蔬菜抗病育种提供了一条崭新而有效的方法。控制瓜类抗病的基因有多种,BAK1和SGR可能是其重要的候选基因。BAK1是一个富含亮氨酸重复序列的膜受体蛋白激酶,它与植物体内一个鞭毛蛋白(FLS2)组成植物病原体分子识别模式受体,感知微生物的侵入,启动病原体分子识别模式,进而启动植物的先天免疫系统,增强作物及产品器官的抗病性。SGR是一个细胞核基因,受衰老诱导而特异表达,其功能缺失导致高等绿色植物器官保持绿色的表型,功能性滞绿在植物的抗逆能力,如抗病性、抗干旱、抗倒伏等方面具有很强的优势。
　　本实验首先建立了稳定高效的黄瓜和甜瓜的再生体系和根癌农杆菌介导的遗传转化体系,在此基础上将抗病基因AtBAK1、CsBAK1和滞绿基因CsSGR分别导入黄瓜和甜瓜,进行基因功能验证和转基因植株抗病性鉴定,为培育黄瓜和甜瓜抗病新品种奠定基础。主要结果如下:
　　 1.基因At4g33430和AAY98500的生物信息学分析。基因At4g33430为拟南芥的AtBAK1基因,DNA序列全长4363 bp,11个外显子,10个内含子；cDNA全长2583 bp,包含一个1848 bp的开放阅读框,编码615个氨基酸,蛋白质分子量为6.8 kD。AAY98500为番茄的SISGR基因,DNA包含4个外显子,3个内含子,cDNA全长约1.2 kb,包含一个816 bp的开放阅读框,编码272个氨基酸,蛋白质分子量为30kD。
　　 2.建立了黄瓜的高效再生体系和稳定的遗传转化体系,验证了AgNO3在黄瓜再生中的促进作用。实验结果证明:3～4 d的黄瓜子叶在MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/LABA+2.0 mg/L AgNO3培养基中再生效率最高,达到86.9％。100 mg/L的Kan完全可以抑制黄瓜不定芽的再生。100～400 mg/L的Cef对黄瓜不定芽的诱导不明显,400 mg/L Cef为侵染后最适宜的抑菌浓度。
　　 3.建立了甜瓜的高效再生体系和稳定的遗传转化体系。2～3 d的甜瓜子叶在MS+2.0 mg/L BA+0.3 mg/L IAA和MS+4.0 mg/L BA+0.3 mg/L IAA培养基中再生频率最高,分别达到93.6％和95.3％,但高浓度的BA易出现玻璃化现象,以MS+2.0 mg/L BA+0.3 mg/L IAA做诱导培养基为宜。100 mg/L的Kan完全可以抑制甜瓜不定芽的再生。100～400 mg/L的Cef对甜瓜不定芽的诱导不明显,400mg/L Cef为侵染后最适宜的抑菌浓度。
　　 4.应用农杆菌介导法将基因AtBAK1、CsBAK1和CsSGR导入黄瓜、甜瓜。获得转AtBAK1基因黄瓜5株、甜瓜7株；转CsBAK1基因黄瓜11株、甜瓜5株；转CsSGR基因黄瓜37株。对部分转基因黄瓜和甜瓜植株提取DNA,经PCR检测证明,外源基因已经整合到黄瓜和甜瓜的基因组中。
　　 5.对转CsSGR基因和非转基因的黄瓜植株进行了叶绿素、光合速率的测定,结果表明转基因植株的不同功能期叶片叶绿素含量和光合速率均高于非转基因植株。暗胁迫下,转基因植株的叶绿素降解速率远低于对照。
　　 6.对转AtBAK1、CsBAK1和CsSGR基因的黄瓜叶片和非转基因黄瓜进行了接种病源实验和MDA含量测定,结果表明转基因植株的抗病能力明显高于非转基因植株。展开▼