普通油茶花发育和遗传转化体系构建初步研究
普通油茶花发育和遗传转化体系构建初步研究
【摘要】： 普通油茶（Camellia oleifera Abel）是我国油茶栽培的主要物种，是典型的花果同时发育多年生常绿树种，开花是油茶产量形成的重要基础。本文分析了普通油茶花发育过程生理生化变化及其影响因子，初步探明了油茶的成花过程生化指标的变化动态，并通过花芽发育过程的转录组和表达谱测序及分析，分离了影响油茶花发育关键基因（FT和PI），并构建了FT基因的超表达和PI基因RNAi干扰植物遗传转化载体以及初步的遗传转化系统，具体结果如下：1.随着普通油茶花芽分化，老叶中可溶性蛋白含量逐渐下降，茎可溶性蛋白含量逐渐上升，新叶中可溶性蛋白含量变化相对平稳；老叶中可溶性糖含量逐渐下降，新梢组织（上叶、下叶和茎）可溶性糖含量变化相对平稳；茎的蔗糖含量上升幅度明显，叶片的蔗糖含量呈“下降-上升-下降”变化趋势；新梢各组织（上叶、下叶和茎）中果糖含量变化趋势相似，呈“下降-上升-下降-上升”趋势，新叶含量比茎高，茎比老叶高；植物激素含量新叶比老叶和茎高，其中含量最高的是脱落酸；新叶的生长素与细胞分裂素比值变化趋势较平缓，而茎和老叶的生长素/细胞分裂素比值变化幅度较大。2.普通油茶花器官形成过程，春梢上各部位组织（上叶、下叶和花芽）中可溶性蛋白和可溶性糖含量呈缓慢上升趋势；蔗糖和果糖变化幅度较大，花芽中的含量普遍比叶片中低；春梢叶片各种激素含量呈“下降-上升-下降”，春梢各部位组织中脱落酸与生长素比值呈“上升-下降-上升-下降”变化，生长素与细胞分裂素比值在花芽中变化平缓，在叶片中呈“下降-上升-下降”变化，上叶和下叶中的比值变化相反。3.在普通油茶花芽转变期，在短日照处理下，可溶性蛋白和可溶性糖新叶部位含量最高，蔗糖在实生苗的老叶部位含量最高；在水分处理条件下，老叶中蔗糖含量明显低于新叶；叶片中的果糖含量在氮素处理时含量最高，在短日照时含量最低；茎中生长素含量普遍比叶片中低，新叶比老叶高，新叶在热处理下生长素含量最高，在光照处理及实生苗中较低；赤霉素含量最高是在生长素处理时的新叶部位，最低为对照处理的茎部位；细胞分裂素含量最高为细胞分裂素处理的新叶部位，脱落酸在春梢不同部位含量变化差异不明显；短日照下的普通油茶茎尖FCA基因相对表达量最高，FLC基因在实生苗茎中表达量最高，FT基因在长日照时茎尖表达量最高。4.转录组测序总共获得28,448,847个reads和5,742,023,480pb碱基，GC含量为46.52%；N50长度为806，普通油茶与葡萄的Unigenes相似度最高，总共SSR数量为8,399个，1kb以上的Unigenes有12,643条，占Unigene库总数的13.38%；Unigenes各数据库功能注释数目依次为：在COG中有9,095条，在GO中有27,201条，在KEGG中有6,431条，在Swissprot中有24,534条，在TrEMBL中有36,393条，在nr中有36,400条，在nt中有30,858条；茎尖中FLC、FCA和FT基因表达量普遍较AP1、AP2和PI基因低，FT基因是油茶成花的关键基因，PI基因与雄蕊发育关系紧密。5.通过对普通油茶花发育的6个时期样品测序，共获得了原始reads数为103,249,386条，平均CycleQ20都为100%，各样品测序reads与转录组部分测序构建的Unigene库的序列对比，对比效率都超过60%，样品间的差异基因分析，共获得了差异表达基因为26,861个。5月9号和8月25日的差异表达基因最少，7月3日和6月15日与其他时期差异表达的基因数量最多。6.普通油茶FT基因编码区序列长度为540pb，编码179个氨基酸，FT基因编码的蛋白有一个磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族（BP）的结构域，与中华猕猴桃的FT基因编码蛋白同源性最高；PI基因编码区序列长度为627，共编码208个氨基酸数，PI基因编码的蛋白有一个MADS-box和K-box蛋白结构域，该蛋白和大豆及四季豆PI基因编码的蛋白同源性最高。7. MS培养基是普通油茶体胚再生最适宜的培养基，长林53号品种较易诱导出胚性愈伤组织，7月27日左右的未成熟胚最容易诱导出体胚，TDZ、2.4-D是体胚诱导最重要的激素，2.4-D、KT、TDZ和CH添加物配比最有利于体胚诱导。选择MS培养基，2mg/L浓度的IAA，0.5mg/L浓度的KT，0.5mg/L浓度的TDZ和500mg/L浓度的CH等组合，有适合于体胚萌发和胚状体生长。8.愈伤组织的潮霉素选择压为120mg/L；外植体预培养时间长短、农杆菌侵染时间长短、共培养时间长短及AS浓度大小对抗性愈伤组织选择都有显著影响，侵染时间对抗性愈伤组织选择影响最为明显，其次是共培养时间、AS浓度和预培养时间；侵染时间、共培养时间及AS浓度大小对农杆菌污染都有极显著影响，侵染时间和AS浓度对农杆菌污染影响最为关键，其次是侵染时间；预培养时间为40d，侵染时间为20min，共培养时间为5天，AS浓度为200mg/L时抗性愈伤组织最多，农杆菌污染率最低。
【学位授予单位】：中国林业科学研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
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