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生物选修专题基因工程.ppt

花匠小妙招
2024-11-07 14:38

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1、专题1:基因工程,基因工程的概念,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需要的基因产物。基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。,1.1 DNA重组技术的基本工具,一.限制性核酸内切酶“分子的手术刀” 二.DNA连接酶“分子缝合针” 三.基因进入受体细胞的体“分子运输车”,一、限制性核酸内切酶“分子手术刀”,（1）性

2、质：一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成。,（2）分布：主要在原核生物中。迄今从不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。（3）限制酶在原核生物中的作用是什么吗？原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是原核生物的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，达到保证自身的安全的目的。,（4）为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解；含有某种限制酶的细胞，其

3、DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。（5）限制酶所识别的序列有什么特点？所识别序列的中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,（5）作用结果：产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。,（6）用同一种限制性酶处理不同DNA片段，会形成同样的黏性末端，可进行重组。,2、DNA连接酶“分子缝合针”,（1）作用：将双链的DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,（2）种类： Ecoli DNA 连接酶从大肠杆菌中分离得到，只能将双链DNA片段互补的粘性末端之

4、间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。 T4 DNA 连接酶从T4噬菌体中分离得到，既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低。,（3）DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？为什么？不是一回事。相同点：两者都是形成磷酸二酯键。不同点： DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板。,3、基因进入受体细胞的运载体,常用运载体：质粒、噬菌体、动植物病毒质粒存在：存在于细菌及酵母菌的染色体以

5、外。特性：是很小的环状DNA分子，在细胞染色体外能够自我复制。,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？作为运载体的条件：（1）必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到运载体上去，而且这些位点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。（2）必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。,（3）必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。（4）必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到受体细胞外的其他生物细胞中的。

6、（5）分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作。故天然的DNA分子一般不能直接用做基因工程运载体。,1.2、基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取； 2、基因表达载体的构建； 3、将目的基因导入受体细胞； 4、目的基因的检测与鉴定；,1、目的基因的获取,目的基因是人们所需要转移或改造的基因，获取目的基因是实施基因工程的第一步。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。,人工合成基因法 1）反转录法：以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需

7、的基因。,目的基因的mRNA,单链DNA(cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录,合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？ 1）DNA序列自动测序仪：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。 2）PCR技术：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。,利用PCR技术扩增目的基因,利用P

8、CR技术扩增, 概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ (做启动子)、 _.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,PCR技术扩增过程,a、DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从引物的5端3端延

9、伸，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR原理,变性,3）从基因文库中获取目的基因：基因文库: 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,2、基因表达载体的构建核心,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够在表达和发挥作用。单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。构建表达载体的目的是

10、为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。,用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。用同一种限制酶切断目的基因，使其产生同样的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。,质粒,DNA分子,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,经此过程，基因表达载体的构建就成功了？,同一种限制酶,基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因,启动子：一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识

11、别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。,终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在所需要的地主停止下来。,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还要有启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,3、将目的基因导入受体细

12、胞,转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,方法：将目的基因导入植物细胞：农杆菌转化法（双子叶植物和祼子植物）、基因枪法（单子叶植物）、花粉管通道法将目的基因导入动物细胞：显微注射法将目的基因导入微生物细胞：感受态细胞,将目的基因导入植物细胞,农杆菌转化法,将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: 首先用Ca2+ 处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态

13、,这种细胞称为感受态细胞. 第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程. 第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少要对受体细胞作怎样的处理？对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测怎样进行检测？通过目的基因上的标记基因，进行筛选和检测,4、目的基因的检测与鉴定,检测：（分子水平）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因：方法DNA分子杂交（

14、DNA+DNA) 检测目的基因是否转录出了mRNA：方法DNA分子杂交(DNA+MRNA) 检测目的基因是否翻译成蛋白质：方法抗原抗体杂交（如果有，表示目的基因已经进行了翻译）,DNA分子杂交技术,分子探针：核酸分子探针是指特定的已知核酸片段（目的基因片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测。满足条件：（1）必须是单链；（2）带有容易被检测出来的标记物（如放射性同位素标记）。核酸分子杂交实质上是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交。,DNA分子杂交示意图,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或

15、目的基因已经转录。,DNA分子杂交示意图,用DNA分子杂交技术可鉴定两个物种之间的亲缘关系的远近。将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。如果杂合部位多，则亲缘关系近，反之则远。,鉴定：（个体水平）抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,1.3、基因工程的应用,（一）、植物基因工程硕果累累（二）、动物基因工程前景广阔含基因工程药品异军突起（

16、三）、基因治疗曙光初照（四）、基因工程与环境保护,（一）、植物基因工程硕果累累,转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良弄作物的品质和利用植物生产药物等方面.,1.抗虫转基因植物,转基因抗虫水稻（绿色植株）与对照（黄色枯萎植株）,1.抗虫转基因植物,2.抗病转基因植物,2.抗病转基因植物,转基因番木瓜抗环斑病毒,2.抗病转基因植物,遭到玉米螟侵害和真菌感染的普通玉米(左)与Bt玉米(右),3.抗逆转基因植物,4.利用转基因改良植物的品质,富含赖氨酸的转基因玉米,4.利用转基因改良植物的品质,转基因矮牵牛呈现出原本没有的花色变异（左侧为对照，中间和右侧为转基因后的变异）,4.利用转基因改良植物的品质,转基因耐贮藏番茄（左）和普通番茄（右）,4.利用转基因改良植物的品质,转乙肝抗原基因的西红柿预防乙肝,基因工程在农业上的应