大花绣球杂种胚直接成苗培养方法.pdf
1、(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202310463629.9(22)申请日 2023.04.26(71)申请人 湖南农业大学地址 410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1号(72)发明人 陈海霞蒋辉吴晓梦王登辉李玉帆陈己任(74)专利代理机构 北京和联顺知识产权代理有限公司 11621专利代理师 郭佳伟(51)Int.Cl.A01H 4/00(2006.01)A01G 31/00(2018.01)A01G 24/15(2018.01)A01G 24/28(2018.01)A01H 1/02(2006.01)(54)发明名称一种大
2、花绣球杂种胚直接成苗培养方法(57)摘要本发明公开了一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，包括以下步骤：步骤1：花粉生活力测定；步骤2：杂交授粉，在母本植株不育花萼片开始展开时，剪除所有的不孕花，同时去除发育状况不良的可育花；当花蕾膨大呈淡紫时，用镊子轻压花蕾，去除花瓣和雄蕊，此时柱头湿润呈“Y”型，可以进行授粉，授粉完成后套袋，1周后去除；步骤3：受精胚珠培养，包括外植体处理及培养条件的选择、诱导培养、壮苗与生根培养和炼苗移栽。本发明通过花粉生活力测定、杂交授粉、受精胚珠培养等培养步骤的设置，可以快速有效的使大花绣球杂种胚直接成苗，从而有效提升了大花绣球的成苗效率，同时很好的节约了大花绣球杂种
3、胚的成苗成本。权利要求书1页 说明书4页 附图1页CN 116636459 A2023.08.25CN 116636459 A1.一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：花粉生活力测定，采用培养液悬滴法测定花粉的萌发率，以花朵开放12天的新鲜花粉为材料，用牙签蘸取花粉并涂抹在培养液中，室温条件下静置8h，然后在200倍显微镜下随机选取3个视野统计花粉萌发率；步骤2：杂交授粉，在母本植株不育花萼片开始展开时，剪除所有的不孕花，同时去除发育状况不良的可育花；当花蕾膨大呈淡紫时，用镊子轻压花蕾，去除花瓣和雄蕊，此时柱头湿润呈“Y”型，可以进行授粉，授粉完成后套袋，1周后
4、去除；步骤3：受精胚珠培养，包括外植体处理及培养条件的选择、诱导培养、壮苗与生根培养和炼苗移栽；其中外植体处理及培养条件的选择具体步骤为：以授粉100d的杂种胚珠为试材，首先用吐温20浸泡5min后立即用流水洗净，然后在70乙醇中浸泡30s，再用次氯酸钠溶液，有效氯含量1，浸泡10min，最后用无菌水清洗45次；在超净工作台上剥开种实，去除果皮，取出胎座和胚珠，然后沿着任意一条腹缝线将着生有数列胚珠的胎座纵切，均分为两部分接种至培养基，接种后培养；诱导培养的具体步骤为：采集授粉后100d的膨大果实，取胚珠接种到MS+1.5mgL16BA+0.2mgL1NAA+1.5mgL1GA3诱导培养基上，
5、将胚珠接种到诱导培养基上进行培养；壮苗与生根培养的具体步骤为：取诱导培养后长势一致的幼苗接种在MS+NAA0.1mgL1培养基中继续培养，每4周更换一次新鲜培养基；炼苗移栽的具体步骤为：将生长健壮的幼苗在室温25左右，自然光照的温室内炼苗，然后移栽到混合基质中，放置在温度为20左右的温室栽培养护。2.根据权利要求1所述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述步骤1中培养液的配方为5蔗糖+150mgL1硼酸+75mgL1氯化钙。3.根据权利要求1所述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述步骤1中花粉萌发以花粉管伸长长度大于或等于花粉粒直径为标准。4.根据权利要求1所
6、述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述步骤2中授粉具体步骤为用棉签蘸取花粉粒，轻触柱头并使其沾满花粉，每天授粉12次，连续授粉3天。5.根据权利要求1所述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述步骤3中所有培养基均添加30mgL1蔗糖、7gL1琼脂，pH值5.8，诱导培养基为MS+1.5mgL16BA+0.2mgL1NAA+1.5mgL1GA3，另添加500mgL1活性炭；壮苗与生根培养基为MS+NAA0.1mgL1。6.根据权利要求1所述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述步骤3中接种后的材料置于室温251，光照时间15hd1，光照度2000
7、3000lx的环境中培养。7.根据权利要求1所述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述步骤3中幼苗培养至90d左右时，植株高约3cm，叶片长度达2cm以上，叶色浓绿，根系茂盛，即可进行炼苗与移栽。8.根据权利要求1所述的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，其特征在于，所述混合基质中泥炭：蛭石：珍珠岩的体积比为6：3：1。权利要求书1/1 页2CN 116636459 A2一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法技术领域0001本发明涉及植物繁殖技术领域，尤其涉及一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法。背景技术0002绣球花Hydrangea macrophylla(Thunb)Ser.又
8、名八仙花、紫阳花等，为虎耳草科八仙花属(即绣球花属)观赏灌木。绣球原产于日本以及中国四川一带，现世界现各地均有栽培，中国主要分布于长江流域以南各省地区。绣球花不仅观赏效果好而且耐阴，既能作盆花栽培，又可种植于庭院、公园、绿地，是园林中重要的观赏植物，在园林绿化、美化中应用广泛，种苗需求量大。0003杂交育种是大花绣球新品种选育的重要方法，然而目前存在杂交后代再生率低的问题，影响育种进程；现有技术中还未有对大花绣球杂种胚直接成苗方法的研究，从而影响大花绣球的成苗效率以及成苗成本。发明内容00041.要解决的技术问题0005本发明的目的是为了解决现有技术中还未有对大花绣球杂种胚直接成苗方法的研究，
9、从而影响大花绣球成苗效率以及成苗成本的问题，而提出的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法。00062.技术方案0007为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：0008一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，包括以下步骤：0009步骤1：花粉生活力测定，采用培养液悬滴法测定花粉的萌发率，以花朵开放12天的新鲜花粉为材料，用牙签蘸取花粉并涂抹在培养液中，室温条件下静置8h，然后在200倍显微镜下随机选取3个视野统计花粉萌发率；0010步骤2：杂交授粉，在母本植株不育花萼片开始展开时，剪除所有的不孕花，同时去除发育状况不良的可育花；当花蕾膨大呈淡紫时，用镊子轻压花蕾，去除花瓣和雄蕊，此时柱头湿润呈“Y
10、”型，可以进行授粉，授粉完成后套袋，1周后去除；0011步骤3：受精胚珠培养，包括外植体处理及培养条件的选择、诱导培养、壮苗与生根培养和炼苗移栽；0012其中外植体处理及培养条件的选择具体步骤为：以授粉100d的杂种胚珠为试材，首先用吐温20浸泡5min后立即用流水洗净，然后在70乙醇中浸泡30s，再用次氯酸钠溶液，有效氯含量1，浸泡10min，最后用无菌水清洗45次；在超净工作台上剥开种实，去除果皮，取出胎座和胚珠，然后沿着任意一条腹缝线将着生有数列胚珠的胎座纵切，均分为两部分接种至培养基，接种后培养；0013诱导培养的具体步骤为：采集授粉后100d的膨大果实，取胚珠接种到MS+1.5mg说
11、明书1/4 页3CN 116636459 A3L16BA+0.2mgL1NAA+1.5mgL1GA3诱导培养基上，将胚珠接种到诱导培养基上进行培养；0014壮苗与生根培养的具体步骤为：取诱导培养后长势一致的幼苗接种在MS+NAA0.1 mgL1培养基中继续培养，每4周更换一次新鲜培养基；0015炼苗移栽的具体步骤为：将生长健壮的幼苗在室温25左右，自然光照的温室内炼苗，然后移栽到混合基质中，放置在温度为20左右的温室栽培养护。0016优选地，所述步骤1中培养液的配方为5蔗糖+150mgL1硼酸+75mgL1氯化钙。0017优选地，所述步骤1中花粉萌发以花粉管伸长长度大于或等于花粉粒直径为标准。
12、0018优选地，所述步骤2中授粉具体步骤为用棉签蘸取花粉粒，轻触柱头并使其沾满花粉，每天授粉12次，连续授粉3天。0019优选地，所述步骤3中所有培养基均添加30mgL1蔗糖、7gL1琼脂，pH值5.8，诱导培养基为MS+1.5mgL16BA+0.2mgL1NAA+1.5mgL1GA3另添加500mgL1活性炭；壮苗和生根培养基为MS+NAA0.1 mgL1。0020优选地，所述步骤3中接种后的材料置于室温251，光照时间15hd1，光照度20003000lx的环境中培养。0021优选地，所述步骤3中幼苗培养至90d左右时，植株高约3cm，叶片长度达2cm以上，叶色浓绿，根系茂盛，即可进行炼苗
13、与移栽。0022优选地，所述混合基质中泥炭：蛭石：珍珠岩的体积比为6：3：1。00233.有益效果0024相比于现有技术，本发明的优点在于：0025本发明中，通过花粉生活力测定、杂交授粉、受精胚珠培养等培养步骤的设置，可以快速有效的使大花绣球杂种胚直接成苗，从而有效提升了大花绣球的成苗效率，同时很好的节约了大花绣球的成苗成本。附图说明0026图1为本发明提出的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法的胚珠萌发进程图；0027图2为本发明提出的一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法的壮苗培养与炼苗移栽图。具体实施方式0028下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显
14、然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。0029实施例1：0030一种大花绣球杂种胚直接成苗培养方法，包括以下步骤：0031步骤1：花粉生活力测定，采用培养液悬滴法测定花粉的萌发率。以花朵开放12天的新鲜花粉为材料，用牙签蘸取花粉并涂抹在培养液中(培养液配方为5蔗糖+150mgL1硼酸+75mgL1氯化钙)，室温条件下静置8h，然后在200倍显微镜下随机选取3个视野统计花粉萌发率(花粉萌发以花粉管伸长长度大于或等于花粉粒直径为标准)；说明书2/4 页4CN 116636459 A40032步骤2：杂交授粉，在母本植株不育花萼片开始展开时，剪除所有的不孕花，同时去除发育状
15、况不良的可育花；当花蕾膨大呈淡紫时，用镊子轻压花蕾，去除花瓣和雄蕊，此时柱头湿润呈“Y”型，可以进行授粉。用棉签蘸取花粉粒，轻触柱头并使其沾满花粉，每天授粉12次，连续授粉3天。授粉完成后套袋，1周后去除；0033步骤3：受精胚珠培养，包括外植体处理及培养条件的选择、诱导培养、壮苗与生根培养和炼苗移栽。0034本实施例中，通过花粉生活力测定、杂交授粉、受精胚珠培养等培养步骤的设置，可以快速有效的使大花绣球杂种胚直接成苗，从而有效提升了大花绣球的成苗效率，同时很好的节约了大花绣球的成苗成本。0035实施例2：0036其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此
16、处的实施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：0037其中外植体处理及培养条件的选择具体步骤为：以授粉100d的杂种胚珠为试材，首先用吐温20浸泡5min后立即用流水洗净，然后在70乙醇中浸泡30s，再用次氯酸钠溶液(有效氯含量1)浸泡10min，最后用无菌水清洗45次。在超净工作台上剥开种实，去除果皮，取出胎座和胚珠，然后沿着任意一条腹缝线将着生有数列胚珠的胎座纵切，均分为两部分接种至培养基；所有培养基均添加30mgL1蔗糖、7gL1琼脂，pH值5.8，诱导培养基另添加500mgL1活性炭。接种后的材料置于室温251，光照时间15hd1，光照度20003000lx的环
17、境中培养；0038实施例3：0039其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：0040诱导培养的具体步骤为：采集授粉后100d的膨大果实，取胚珠接种到MS+1.5mgL16BA+0.2mgL1NAA+1.5mgL1GA3诱导培养基上，诱导萌发率高达100，单果成苗数为16.18棵。由图1所示，将胚珠接种到诱导培养基上，培养10d后由胚珠直接萌发成苗(图1A)，随后陆续萌发，20d左右时长成从生苗状(图1B)，培养至35d左右时，幼苗叶片呈黄绿色，植株健壮(图1C)；0041实施例4：00
18、42其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：0043壮苗与生根培养的具体步骤为：取诱导培养后长势一致的幼苗接种在MS+NAA0.1 mgL1培养基中继续培养，每4周更换一次新鲜培养基。由图2可知，培养60d时植株健壮，茎叶伸展，叶色浓绿，根系较发达(图2A)；培养至90d左右时，植株高约3cm，叶片长度达2cm以上，叶色浓绿，根系茂盛(图2B)，即可进行炼苗与移栽(图2C)；0044实施例5：0045其具有上述实施例的实施内容，其中，对于上述实施例的具体实施方式可参阅上述描述，此处的实
19、施例不作重复详述；而在本申请实施例中，其与上述实施例的区别在于：0046炼苗移栽的具体步骤为：将生长健壮的幼苗在室温25左右，自然光照的温室内炼苗，然后移栽到泥炭：蛭石：珍珠岩6：3：1(体积比)的混合基质中，放置在温度为20左说明书3/4 页5CN 116636459 A5右的温室栽培养护，35d后即能成活，成活率为93左右。0047以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。说明书4/4 页6CN 116636459 A6图1图2说明书附图1/1 页7CN 116636459 A7
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