摘要: 通过构建微宇宙湿地柱模拟气候升温的方法,采用高通量测序和核磁共振技术,分别研究了湿地土壤微生物群落和磷素形态对暖化作用的响应特征.结果表明,暖化作用导致了Firmicutes、Clostridia、Clostridiales、Clostridiaceae和Clostridium的相对丰度分别显著下降65%~98%、69%~87%、67%~87%、73%~97%和74%~93%,这表明暖化作用对不同分类水平上的物种Firmicutes到Clostridium具有显著的抑制效应.通过主坐标分析和聚类分析,不同湿地柱采样点的暖化组与对照组样本表现出显著的分离特征,揭示了暖化作用能够诱导微生物群落组成发生显著性变化.磷酸单酯和正磷酸盐是各湿地柱土壤主导的磷素形态,同时暖化作用导致了XX湿地柱采样点的磷酸单酯和正磷酸盐相对丰度分别显著升高275%和下降20%,JH湿地柱采样点的磷酸单酯和多聚磷酸盐相对丰度分别显著升高85%和下降49%,这表明不同磷素形态对暖化作用的响应具有土壤异质性特征.通过典型对应分析,揭示了暖化条件下微生物群落组成的显著变化对磷素形态具有显著的影响效应.
Effect of Simulated Climate Warming on Microbial Community and Phosphorus Forms in Wetland Soils
TENG Chang-yun1 , SHEN Jian-guo2, WANG Zhong2, WANG Hang1, LI Hong-yi1, ZHANG Zhi-jian1,3
Abstract: Microbial community and phosphorus forms in response to simulated climate warming were studied by high-throughput sequencing and 31P nuclear magnetic resonance(31P-NMR) respectively, which were from wetland soils in constructed microcosm columns. The results revealed that relative abundances of Firmicutes, Clostridia, Clostridiales, Clostridiaceae and Clostridium were significantly decreased by 65%-98%, 69%-87%, 67%-87%, 73%-97% and 74%-93% under warming condition respectively, suggesting warming had a significant inhibitory effect on the bacterial lineage from Firmicutes to Clostridium at different taxonomic level. Particularly, principal coordinate analysis and cluster analysis also demonstrated warming had a significant effect on microbial community structure with obvious separation of samples between control and warmed groups from each wetland column site. Phosphorus forms were dominated by phosphomonoester and orthophosphate in each wetland column soil, which were significantly increased and decreased by 275% and 20% in XX wetland column soil respectively. Similarly, phosphomonoester and polyphosphate were also found to be increased and decreased by 85% and 49% in JH wetland column soil respectively, indicating that phosphorus forms in response to warming had soil heterogeneity. Canonical correspondence analysis showed that obvious changes in microbial community composition had significant effects on phosphorus forms under warming condition.
Key words: microcosm climate warming microbial community phosphorus forms high-throughput sequencing 31P-NMR wetland soils
据推测到2100年,全球气温将上升大约1.4~5.8℃[1],同时我国首份《气候变化国家评估报告》指出:相对于1961~1990年全国气温平均值,2020年我国年平均气温将增加1.3~2.1℃,并且至2050年将增加2.3~3.3℃[2].众所周知,伴随经济的发展,水体富营养化成为了我国乃至全球水环境污染的核心生态问题之一.此外,研究发现气候变暖能够加剧水体富营养化过程[3].其中磷素被认为是导致水体富营养化的关键限制因子[4],湿地土壤磷素以无机磷和有机磷两大类形式存在.土壤是水体中磷素的重要蓄积库.其迁移转化是湿地生态系统中土-水界面间磷素循环的主要过程,直接影响水体富营养化过程.因而,在全球气候变暖条件下,研究湿地土壤磷素的生物地球化学循环过程、“源-汇”演替及其机制等科学问题对于管理湿地生态系统及保障湿地生态系统的健康,发挥其稳定的生态功能提供了前瞻性的理论基础.同时,微生物是湿地土壤磷素生物地球化学循环过程中重要的参与者,首先微生物能够提高湿地土壤植物有效磷的含量[5],例如植物根际菌能够有效地溶解土壤中沉淀或吸附态的无机磷成为有效磷形态[6].其次,由于微生物本身具有高效的磷素吸收系统,故微生物也与其他生物体发生竞争并吸收土壤中的有效磷[7].研究表明升高的土壤温度能够影响微生物活动进而导致土壤磷素释放到水体中[8],因此研究暖化条件下湿地土壤微生物群落的变化特征对认识磷素生物地球化学循环过程具有重要意义.
湿地土壤升温不仅对磷素形态具有显著地影响,如不同磷素形态间的相互转换[9].而且会影响微生物群落组成,如微生物种类和数量[10],进一步推测出暖化诱导下土壤微生物群落组成与磷素形态可能具有潜在地关联性及相互影响效应.因此,本文以暖化湿地微宇宙生境研究平台为基础,选取了长三角南区六处具有不同磷库特征的湿地区域作为研究对象,开展暖化条件下土壤磷库与微生物群落特征及其关联性研究,以期为探究暖化条件下微生物驱动的湿地土壤磷素生物地球化学循环机制提供一定的理论基础.
1 材料与方法 1.1 微宇宙平台设计及样品收集
关于本实验构建的人工智能微宇宙湿地柱研究平台的详细信息可见参考文献[11]中的相关报道.简而言之,将从长三角南区六处湿地采样点收集的表层土壤及上覆水样品分别填充在透明的PVC塑料管中构成微宇宙湿地柱并置于辅助水箱中于室外长期培养,同时对每个采样点分别设置3个平行的对照组(control, C)和暖化组(warmed, W),即对照组湿地柱处于自然状态,暖化组湿地柱通过温控智能设备升温3℃.此外,六处湿地采样点地理位置及基本理化特征可参考文献研究报道[12],即绍兴镜湖湿地公园(JH)、长兴包漾河(BY)、德清下渚湖湿地(XZ)、桐乡养鸭塘(YT)、嘉兴石臼漾水源地(SJ)和杭州西溪湿地公园(XX).其中SJ属于低营养化磷库湿地,JH属于中低营养化磷库湿地,XZ、XX、BY属于中高营养化磷库湿地,YT属于高营养化磷库湿地.该微宇宙暖化湿地柱实验平台从2008年5月运行至今.为探究暖化条件下湿地土壤磷库与微生物群落特征及其关联性,本实验于2016年10月15日收集了各湿地柱中约100 g土壤新鲜样品,即共计收集了36个土壤样本,每个湿地采样点的暖化组和对照组分别包含3个生物性重复.各湿地柱土壤样本一部分用于微生物群落(16S rRNA gene)高通量测序分析,另一部分用于磷素核磁共振(31P-NMR)表征分析.
1.2 微生物群落测序分析
土壤全基因组DNA提取根据美国MoBio公司的强力土壤DNA提取试剂盒说明进行,提取的土壤DNA送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司对16S rRNA gene的V4~V5高变区进行高通量测序分析,其测序策略参考文献相关报道[13].测序得到的原始数据使用QIIME v1.9.1软件[14]进行预处理,然后使用Uclust v1.2.22q软件进行OTUs聚类,其相似性阈值设为97%,最后再采用Greengenes数据库对OTUs进行分类学鉴定[15].
1.3 核磁共振表征分析
土壤磷素提取过程及检测分析可参考文献[16],步骤如下:称取3.00 g冷冻干燥的土壤样本放置于50 mL离心管中并加入30 mL 0.20 mol·L-1 NaOH和0.050 mol·L-1 Na2EDTA混合液,然后在20℃室温条件下缓慢振荡浸提16 h,接着在10 000 r·min-1下离心20 min获取上清液.该上清液经过-20℃冷藏36 h后被冷冻干燥并研磨成粉末,大约300 mg的粉末再重新溶解到由0.50 mL D2O、0.30 mL 10 mol·L-1NaOH和0.30 mL NaOH-EDTA提取液组成的混合液中.溶解的样品再经过20 min超声混合,10 000 r·min-1下离心10 min再次获得上清液,该上清液被装载到5 mm规格的核磁管中并采用布鲁克公司的600 MHz核磁共振波谱仪进行检测.其检测相关参数为:脉冲角度90°,捕集时间0.68 s,脉冲延迟4.0 s,脉冲宽度17.9 μs,自旋频率10 Hz,扫描次数范围2 400~2 800,测定温度20℃.所有31P化学移位均参照85%的正磷酸.最后对于获得的31P-NMR谱图采用MestReNova7.0软件进行分析,其中所有谱图的正磷酸化学移位被校正在6.0 ppm.其他磷素形态化合物的化学移位根据相关参考文献进行确定[17].对于单个磷素形态化合物,其相对丰度为其对应的峰值面积与全体磷素峰值面积和之比.
1.4 统计分析
本实验采用PAST3.0软件[18]对微生物群落数据进行主坐标分析(principal coordinate analysis)、典型对应分析(canonical correspondence analysis)、聚类分析(cluster analysis)及Spearman秩相关性分析等多元统计分析.采用LEfSe(linear discriminant analysis coupled with effect size)在线软件[19]进行组间微生物群落组成差异分析.同时采用SPSS 17.0软件进行单变量方差分析和显著性检验及一般描述性统计分析,多重比较方差分析运用LSD法,其中P<0.05表示组间具有显著性差异.
2 结果与分析 2.1 微生物群落组成分析
对微生物群落门水平物种组成而言(图 1),其中others包含相对丰度低于1%和未知的物种,各湿地柱采样点暖化组的优势物种主要为Proteobacteria(26%~40%)和Chloroflexi(18%~29%),而各湿地柱采样点对照组的优势物种主要为Proteobacteria(23%~30%)、Chloroflexi(13%~20%)和Firmicutes(21%~30%). One-way ANOVA的LSD多重比较分析表明:对于Firmicutes的相对丰度,各湿地柱采样点的暖化组与对照组之间均具有统计学显著性(P<0.05).即和对照组相比,暖化作用导致了JH、XZ、YT、XX、BY和SJ湿地柱采样点的Firmicutes相对丰度分别显著下降88%、68%、72%、65%、85%和98%.
对微生物群落纲水平物种组成而言(图 2),其中others包含相对丰度低于1%和未知的物种,各湿地柱采样点暖化组的优势物种主要为δ-Proteobacteria(13%~24%)和Anaerolineae(15%~24%).而各湿地柱采样点对照组的优势物种主要为δ-Proteobacteria(13%~18%)、Anaerolineae(10%~17%)和Clostridia(20%~30%). One-way ANOVA的LSD多重比较分析表明:对于Clostridia的相对丰度(P<0.05),各湿地柱采样点的暖化组与对照组之间均具有统计学显著性.即和对照组相比,暖化作用导致了JH、XZ、YT、XX、BY和SJ湿地柱采样点的Clostridia相对丰度分别显著下降86%、69%、75%、67%、87%和73%.
对微生物群落目水平物种组成而言(图 3),其中others包含相对丰度低于1%和未知的物种,“o_”表示未知的目水平物种.各湿地柱采样点暖化组的优势物种主要为GCA004(3%~6%)、Clostridiales(3%~8%)和Syntrophobacterales(4%~7%).而各湿地柱采样点对照组的优势物种主要为Clostridiales(20%~29%). One-way ANOVA的LSD多重比较分析表明:对于Clostridiales的相对丰度,各湿地柱采样点的暖化组与对照组之间均具有统计学显著(P<0.05).即和对照组相比,暖化作用导致了JH、XZ、YT、XX、BY和SJ湿地柱采样点的Clostridiales相对丰度分别显著下降87%、70%、76%、67%、87%和73%.
对微生物群落科水平物种组成而言(图 4),其中others包含相对丰度低于1%和未知的物种,“o_”和“f_”分别表示未知的纲水平和科水平物种.各湿地柱暖化组的优势物种主要为未知的o_GCA004;f_(3%~6%)和Thermodesulfovibrionaceae(2%~8%).而各湿地柱采样点对照组的优势物种主要为Clostridiaceae(19%~28%). One-way ANOVA的LSD多重比较分析表明:对于Clostridiaceae的相对丰度(P<0.05),各湿地柱采样点的暖化组与对照组之间均具有统计学显著性.即和对照组相比,暖化作用导致了JH、XZ、YT、XX、BY和SJ湿地柱采样点的Clostridiaceae相对丰度分别显著下降97%、77%、82%、73%、91%和76%.
对微生物群落属水平物种组成而言(图 5),其中others包含相对丰度低于1%和未知的物种,“o_”、“f_”和“g_”分别表示未知的纲水平、科水平和属水平物种.各湿地柱采样点暖化组的优势物种主要为未知的GCA004; f_; g_ (3%~6%)、BPC076; f_; g_ (1%~5%)和Clostridium (2%~6%). One-way ANOVA的LSD多重比较分析表明:对于Clostridium的相对丰度,各湿地柱采样点的暖化组与对照组之间均具有统计学显著性(P<0.05).即和对照组相比,暖化作用导致了JH、XZ、YT、XX、BY和SJ湿地柱采样点的Clostridium相对丰度分别显著下降93%、78%、83%、74%、91%和76%.
2.2 微生物群落属间差异分析
主坐标分析(图 6)展示了PCoA1和PCoA2能够分别解释83%和5%的微生物群落属水平物种组成的方差变异.其中红色标签代表所有暖化组样本,黑色标签代表所有对照组样本.实心点代表湿地柱采样点JH、加号代表湿地柱采样点XZ、方形代表湿地柱采样点YT、菱形代表湿地柱采样点XX、星号代表湿地柱采样点BY和三角形代表湿地柱采样点SJ.显然地,各湿地柱采样点的暖化组与对照组样本分别沿着PCoA1和PCoA2表现出了显著的分离特征.进一步地,聚类分析(图 7)也揭示了不同湿地柱采样点的暖化组和对照组样本明显聚类为两组,即组一包含所有暖化组样本,组二包含所有对照组样本,这表明暖化作用对湿地土壤微生物群落结构组成具有显著性影响效应.为了全面寻找在暖化组和对照组之间具有显著差异影响效应的单个物种,本研究将所有样本整体分为暖化和对照两组并进行LEfSe分析(图 8),仅得分值大于3.0的物种被展示.结果展示暖化组和对照组在不同分类水平上共有18个物种表现出了显著性的组间差异,其中得分值的大小也代表了每个差异物种在各自分组中的影响效应大小.特别地,对于微生物群落在纲水平上的物种组成,暖化组富集到的具有显著影响效应的纲水平物种有α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、Nitrospira、Synechococcophycideae、Pedosphaerae,而对照组富集到的具有显著影响效应的纲水平物种是Clostridia.这表明微生物群落组成在不同分类水平上对暖化作用具有不同的响应特征,也说明了暖化诱导下微生物群落组成的显著变化与特定物种的消长具有明显的相关性.
2.3 磷素组成分析
核磁共振谱图(图 9)揭示了各湿地柱土壤中六类磷素形态均被检测到,即正磷酸盐(orthophosphate, 6.0 ppm)、磷酸单酯(phosphomonoester, 2.6~5.9 ppm)、磷酸二酯(phosphodiester, 2.5~-3.8 ppm)、焦磷酸盐(pyrophosphate, -4.0~-5.0 ppm)、多聚磷酸盐(polyphosphate, -5.5~-25.0 ppm)和膦酸脂(phosphonate, 7.0~28.0 ppm).对应的各磷素形态相对丰度(图 10)分别为正磷酸盐(Ortho-P, 35%~88%)、磷酸单酯(Mono-P, 8%~50%)、磷酸二酯(Di-P, 1%~9%)、焦磷酸盐(Pyro-P, 0.2%~2%)、多聚磷酸盐(Poly-P, 1%~10%)、膦酸脂(Phon-P, 1%~13%). One-way ANOVA的LSD多重比较分析表明:对于正磷酸盐的相对丰度,XX湿地柱采样点的暖化组和对照组之间具有统计学显著性(P<0.05).对于磷酸单酯的相对丰度,JH和XX湿地柱采样点的暖化组和对照组之间具有统计学显著性(P<0.05).对于磷酸二酯的相对丰度,YT湿地柱采样点的暖化组和对照组之间具有统计学显著性(P<0.05).对于焦磷酸盐的相对丰度,SJ湿地柱采样点的暖化组和对照组之间具有统计学显著性(P<0.05).对于多聚磷酸盐的相对丰度(P<0.05),JH湿地柱采样点的暖化组和对照组之间具有统计学显著性(P<0.05).即和对照组相比,暖化作用导致了XX湿地柱采样点的正磷酸盐相对丰度显著下降20%,JH和XX湿地柱采样点的磷酸单酯相对丰度分别显著升高85%和275%. YT湿地柱采样点的磷酸二酯相对丰度显著升高87%,SJ湿地柱采样点的焦磷酸盐相对丰度显著下降41%,JH湿地柱采样点的多聚磷酸盐相对丰度显著下降49%.这表明不同磷素形态组成对暖化作用的响应具有土壤异质性特征.
2.4 微生物群落与磷素关联分析
典型对应分析(图 11)揭示了CCA1和CCA2分别解释了79%和19%的磷素形态组成的方差变异,这表明微生物群落组成对磷素形态具有显著的影响效应.其中由LEfSe分析得到的纲水平差异物种(图 8)被挑选代表整个纲水平微生物群落组成,蓝色实心点点代表单个磷素形态,即正磷酸盐(Ortho-P)、磷酸单酯(Mono-P)、磷酸二酯(Di-P)、焦磷酸盐(Pyro-P)、多聚磷酸盐(Poly-P)和膦酸脂(Phon-P).绿色线段代表单个物种,线段长度越长代表其对整体磷素形态组成影响作用越大.红色标签代表所有暖化组样本,黑色标签代表所有对照组样本,其中实心点代表湿地柱采样点JH、加号代表湿地柱采样点XZ、方形代表湿地柱采样点YT、菱形代表湿地柱采样点XX、星号代表湿地柱采样点BY和三角形代表湿地柱采样点SJ.结果表明:各湿地柱采样点的暖化组与对照组样本分别沿着CCA1和CCA2表现出显著的分离特征,其中CCA1与α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和Synechococcophycideae呈正相关,与δ-Proteobacteria、Nitrospira、Pedosphaerae和Clostridia呈负相关.而CCA2主要与β-Proteobacteria和Pedosphaerae呈正相关,与Nitrospira和Clostridia呈负相关.这表明不同的物种对磷素形态组成的影响效应具有差异性.进一步地典型对应分析揭示了暖化诱导下α-Proteobacteria、Synechococcophycideae、δ-Proteobacteria和Nitrospira是影响磷素形态组成的主要纲水平物种.同时Spearman秩相关性分析也揭示了α-Proteobacteria分别与Phon-P(R=0.51, P<0.05),Di-P(R=0.33, P<0.05),Poly-P(R=0.45, P<0.05) 具有显著的正相关性,与Ortho-P(R=-0.40, P<0.05) 具有显著的负相关性.特别地,Pyro-P分别与δ-Proteobacteria(R=-0.46, P<0.05),Nitrospira(R=-0.39, P<0.05) 呈现显著的负相关性,而与Synechococcophycideae(R=0.41, P<0.05),α-Proteobacteria(R=0.33, P<0.05) 呈现显著的正相关性.这表明暖化条件下单个物种的变化与单个磷素形态的变化具有相应的内在关联性.因此,典型对应分析和Spearman秩相关性分析揭示了暖化诱导下微生物群落组成的变化与磷素形态的变化具有显著的相关性.
3 讨论
尽管Supramaniam等[20]发现Firmicutes的相对丰度在短期的土壤升温条件下呈现出显著性升高特征,它被认为Firmicutes作为革兰氏阳性菌在极端条件下(如高温)能够形成孢子而适应环境变化[21].然而在笔者长达8年的土壤升温实验中,通过对微生物群落物种组成在不同分类学水平上的优势物种分析,本研究发现各湿地柱采样点从Firmicutes到Clostridium这一世系物种的相对丰度在暖化诱导下呈现大幅度下降现象(图 1~5),这可能归因于Proteobacteria在持续暖化诱导下成为了主导的优势物种且在暖化条件下具有显著的影响效应(图 8),进而使得微生物群落组成发生了显著性变化(图 6和图 7). DeAngelis等[22]发现长期的土壤升温能够显著增加Proteobacteria的丰度.此外,Rousk等[23]发现提升的温度能够加速土壤有效基质的消耗进而使得不同微生物之间产生显著的竞争现象,从而导致某些物种的丰度因为营养物质的缺乏而下降[24].同时土壤升温也能够导致某些适冷微生物的死亡[25].这说明不同种类的土壤微生物在暖化诱导下具有不同的环境适应性.因此Firmicutes到Clostridium这一世系物种可能对长期暖化诱导下的土壤环境变化不适应(如营养物质的缺乏)而失去竞争优势,从而导致了该世系物种呈现大幅度消亡特征. Proteobacteria物种可能适应了长期暖化诱导下的环境变化从而成为了优势物种[26],获得了更多的有效基质的供应[27](如碳基质).先前的研究表明暖化条件下微生物群落组成与功能的显著性变化能够导致土壤碳库发生变化[28],同时由于磷库与碳库具有潜在的耦合效应,即碳库的变化能够引发磷库的响应[29],因此本研究认为暖化诱导下土壤微生物群落组成变化与磷库变化具有潜在的相关性(图 11).即暖化诱导下土壤微生物群落组成的显著变化可能会导致磷库的潜在变化[30].在笔者的观测中,除BY和XZ湿地柱采样点外,其他各湿地柱采样点均有磷素形态(如JH和XX湿地柱采样点的磷酸单酯)对暖化作用表现出了显著的响应特征(图 9).这是合理的,Xiong等[31]发现暖化效应可能会被潜在的土壤类型及植被特征所掩盖,而且磷库的变化与湿地土壤营养状态具有潜在的相关性[32].那可能导致某些类型的湿地土壤磷库对暖化作用没有明显地响应特征而其他类型的湿地土壤磷库具有明显的响应特征.同时Allison等[33]发现暖化诱导下能够抑制土壤微生物的活性,从而降低了土壤有机质的分解速率[34].另外Wu等[35]发现升高的土壤温度也能够抑制磷酸酶活性,这说明暖化诱导下可能会降低有机磷组分的分解速率从而使得有机磷组分的相对丰度呈现出升高的特征,例如XX湿地柱采样点的磷酸单酯在暖化条件下呈现出显著的升高特征(图 10).因此,本研究的暖化实验表明长期的暖化作用能够导致微生物群落组成发生显著性变化,进而导致土壤磷库的潜在变化.
4 结论
对土壤微生物群落组成而言,暖化作用导致了Firmicutes到Clostridium这一世系物种的相对丰度呈现出显著的下降特征.通过主坐标分析和聚类分析,揭示了暖化作用对微生物群落组成具有显著性影响效应.对土壤磷素组成而言,磷酸单酯和正磷酸盐是湿地土壤主要的磷素形态,且不同磷素形态对暖化作用的响应具有土壤异质性特征.通过典型对应分析,揭示了暖化诱导下土壤微生物群落组成的显著性变化能够导致磷库不同组分发生潜在变化.
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