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一种复合生防制剂及其制备方法和应用的制作方法

花匠小妙招
2024-11-09 11:27

专利名称：一种复合生防制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及生防制剂-植物提取液与生物菌复合的生防制剂及其制备方法和在防治植物病害方面的应用。
背景技术：
在世界范围内，植物病害普遍地给农业生产造成严重的损失。现以水稻根线虫 (Hirschmannielaspp.)为例，根线虫是水稻的重要寄生线虫病害，主要侵染稻根，直接影响水稻分蘖，据估计全世界有58%的水稻田遭潜根线虫的严重侵害，产量损失达25%，重者达40%。目前，化学防治仍是植物寄生线虫病害最主要的防治措施，但诸如氯化苦、溴甲烷、克百威、克线磷、灭多威等传统化学杀线剂的使用成本高，环境相容性较差。随着绿色消费观念的形成和迅速普及，迫切需要开发出安全、高效、低毒的新型生物合理杀线虫剂。这类植物病害在目前生产上主要以化学防治为主，不仅药剂难以长期持续有效，还严重污染环境。农作物施用农药后，极大影响品质，且严重危害人体健康，导致人畜中毒等后果。随着人类环保意识的加强，大力发展绿色农业已经成为新的时代要求，生物防治作为绿色农业的内容越来越受到人们的关注。在植物病害生物防治领域中，微生物所发挥的作用越来越大，微生物农药的研究逐步成为生物防治的支柱产业。目前，植物病害的生防菌多，是从土壤、根际或植物体表分离的真菌和细菌，但其所处的生态环境因受到外界的紫外线、暴风雨和化学物质等恶劣环境因素的影响，致使其定殖力差，往往在实验室中有一定的防治效果，而在大田生产实际中往往会出现防效不稳定。加之由于生物防治菌对化学杀菌剂普遍敏感，且其效期短，对多数疫病难以起到防治作用，严重限制了其应用范围。因此，增加生物防治菌的抗化学杀菌剂的能力、扩大对病菌的防治范围，成为当前急需解决的技术难题。

发明内容
本发明着眼点在于选用对多种植物病原菌有抑菌活性并且可使作物增产的植物，对其组织液进行提取，再与自筛菌种复配，制成一种复合生防制剂，使其能够防治多种病害，且又具有增产作用，在多效性及广谱性上优于现有的微生物制剂。本发明的目的是提供一种广谱抗病促生长的植物提取液、生物菌复合生防制剂。本发明人以植物生态学原理为基础，从具有抗菌作用的臭椿(Ailanthus altissima)、夹竹桃(Amsonia tabernaemontana)等植物组织中，提取具有防治植物病害作用的组织提取液，经与生物菌复配后，进行抑菌能力测试等试验，经过大量实验筛选，确定了抑菌能力强、抑菌谱宽的复配方案，最终得到本发明臭椿提取液复合生防制剂。经过实验室、盆栽和大田实验对比，证明本发明复合生物制剂可以直接对病原菌产生拮抗作用和诱导作物产生抗病作用，同时具有防治线虫病效果，克服了目前一些生防药物防治效果单一的问题。另外，本发明的定殖性好、受环境影响小，能与植物长期共存，作用稳定持久。实验同时表明，本发明复合生防制剂，在防治多种植物病害的同时，对植物生长具有显著促进作用，使综合防治与作物增产的目的实现成为可能。本发明人经过大量实验研究，创新了制备臭椿植物组织提取液关键技术，并利用自筛菌种进行复配，成功地研制出制出含有臭椿提取液的复合生防制剂，收到非常好的防病抗病和杀线虫效果，经过盆栽试验、大田试验及相关对比试验证明，本发明复合生防制剂在农作物、果树、蔬菜等植物方面具有广谱抗菌、防病治病效果。本发明所述的含有臭椿提取液的复合生防制剂，其主要活性组分包括臭椿植物组织提取液、夹竹桃植物组织提取液以及自筛哈茨木霉(Trichoderma harzianum)复合菌种 MDCGTH 18的发酵培养物。其中，哈茨木霉复合菌种MDCGTH 18已在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)进行保藏，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏日期为2009年3月19号，保藏编号为CGMCCN0. 2965。上述复合生物制剂中，各活性组分的重量用量比例为臭椿提取液夹竹桃提取液哈茨木霉复合菌发酵培养物=(1 2) (1 2) (1 2)。依据药效和经济成本多方综合考虑，各活性组分的优选用量比例为1 2 1。上述臭椿植物组织提取液是采集臭椿叶、皮为原料，经烘干、粉碎后，用乙醇提取制得。上述夹竹桃植物组织提取液是采集夹竹桃花、叶、皮为原料，经烘干、粉碎后，用乙醇提取制得。上述哈茨木霉复合菌发酵培养物是用哈茨木霉(Trichodermaharzianum)复合菌种MDCGTH 18，经培养发酵制得。本发明所述复合生防制剂的具体制备步骤如下1.植物组织提取液的制备方法(1)臭椿提取液的制备方法如下①臭椿采集于四月份分别收集选取无虫害、无菌感染、无腐烂的臭椿的叶、皮，洗去浮尘，晾干备用。②烘干将采集到的臭椿叶、皮原料分别置于干燥箱，50°C烘干Mh③粉碎将烘干后的臭椿叶、皮按(50 80) (20 50)重量比例混合，用破碎机粉碎，过20目分样筛，④提取以95%乙醇为提取剂，按每100L乙醇处理6kg干燥臭椿粉的配料比例，将臭椿叶、皮混合粉末投入预热至50°C的提取剂乙醇中，搅拌均勻并自然冷却至25°C，然后在300r/min搅拌下，浸泡提取M小时。⑤过滤过滤除去固体残渣，所得提取液用于复配。(2)夹竹桃提取液制备方法如下①夹竹桃采集分别收集选取无虫害、无菌感染、无腐烂的夹竹桃的花、叶、皮，洗去浮尘，晾干备用。②烘干将采集到的夹竹桃的花、叶、皮分别置于干燥箱，50°C烘干Μι。③粉碎将烘干后的夹竹桃的花、叶、皮按(40 50) (30 40) (20 30) 重量比例混合，用破碎机粉碎，过20目分样筛。
④提取以95%乙醇为提取剂，按每100L乙醇处理6kg干燥夹竹桃粉的配料比例，将夹竹桃的花、叶、皮混合粉末投入预热至50°C的提取剂乙醇中，搅拌均勻并自然冷却至25°C，然后在300r/min搅拌下，浸泡提取M小时。⑤过滤过滤除去固体残渣，所得提取液用于复配。2.哈茨木霉复合菌发酵培养物的制备(1)哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的筛选①样品的采集山东莱芜果园苹果树下土壤；②分离纯化用无菌生理盐水作梯度稀释，TSM培养基(木霉菌半选择培养基)平板上培养，挑取菌落形态近似木霉菌的单菌落，转接PDA平板纯化培养，经镜检、其它理化检验鉴定为哈茨木霉菌，编号保存于PDA斜面上。上述TSM 培养基(木霉菌半选择培养基)=MgSO4 · 7H20 0. lg, K2HPO4,0. 45g，KCI 0. 08g，NH4NO3O. 5g，葡萄糖1. 54，玫瑰红0. 08，60%敌克松可湿性粉剂0. 15g，PCNBO. lg，琼脂7. 5g，水500mL。121°C灭菌20min备用，无菌操作加入氯霉素，使培养基氯霉素含量达到 100μ g/mL0上述PDA培养基取土豆100g，洗净切成小块，用水煮沸30min，用纱布过滤，保留滤液，加入5g葡萄糖，7. 5g琼脂，定容至500mL，121°C灭菌20min备用，无菌操作加入氯霉
素，使培养基氯霉素含量达到100μ g/mL。③筛选PDA平板中加入指示病原菌株，测定自筛哈茨木霉菌的抑菌带宽、抑菌能力，用以选择生产菌种。(2)毛壳菌(Chaetomium globosum)的筛选①样品的采集山东莱芜果园桃树下土壤；②筛选分别称取2g不同土壤样品各放入一个三角烧瓶中，每瓶加无菌水20mL，置于恒温箱中培养3d。然后在无菌室内分别接一环菌悬液到液体培养基中(液体培养基内预先放入一条IcmX 5cm的滤纸提供碳源)。在恒温箱中培养7d，挑选在滤纸条上生长的菌落，分别接入灭菌后的平皿培养基进一步培养3 4d后，挑取少许菌落制成玻片，镜检确定毛壳菌菌株。上述液体培养基为(NH4)2SO4O.2g，MgSO4O. 05g，KH2PO4O. lg, CaCl2O. lg, H2O 100ml, pH 5. 5 ;121°C 灭菌 20min 备用。上述平皿培养基为CMC-Na20g, KH2P042g, (NH4)2SO4L 4g, MgSO4O. 3g, CaCl2O. 3g, FeSO4 ‘ 7H20 5mg，MnSO4L 6mg，ZnCl2L 7mg，琼脂 20g，H2O 1000ml, pH 5. 5 ;121°C灭菌 20min③分离纯化从平皿培养基中挑取长有毛壳菌的菌落，按照平皿稀释划线法分离接种。于恒温箱中倒置培养3d，然后选择典型的毛壳菌单菌落，转接到相应的斜面培养基上，经培养后得到纯的毛壳菌菌种。④筛选抗性能力强的毛壳菌在培养基中加入多菌灵(10yg/ml)，选择能正常生长的毛壳菌作为生产菌株。C3)混合将上述筛选出的优势明显的毛壳菌菌株与哈茨木霉菌菌株，按2 1比例进行混合，即获得哈茨木霉(Trichodermaharzianum)MDCGTH 18菌种。该菌种已于2009 年3月19日在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC
6NO. 2965。(4)复合菌的发酵培养①斜面培养采用固体PDA培养基，将哈茨木霉MDCGTH 18复合菌种接种在试管培养基上，28°C培养2 3天。②茄瓶培养采用液体PD培养基(除不使用琼脂外，配方与PDA培养基相同，)，将试管菌种接种在茄瓶液体培养基中，置于摇床上振荡培养3 4天。③液体菌种培养物采用种子培养基玉米粉2%，葡萄糖0. 5%，豆饼粉1 %，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.3%，碳酸钙1%，pH 6.0 ；在121°C灭菌40min，将1 2个茄瓶的种子用无菌水洗下，接种于150立升的种子罐内，30°C培养，通气量1 :0. 6 0.8，搅拌速度为200r/min，培养时间为36 48h。④固体菌种培养物采用固体培养基麸皮稻壳玉米粉=7 1 2，含水量为70% (其中包括接种的液体菌种的水分)，pH6.0 ;121°C灭菌40min后，以循环水冷却，在接种器内将液体菌种与固体培养基混合均勻，接种量为5 10%，接种完毕转移到固体培养室内培养，30°C培养，培养时间为5 7天，最终产品菌体密度为IO8 IO9个/g。3.复合生防制剂的配制将上述制备的臭椿提取液、夹竹桃提取液和哈茨木霉MDCGTH 18发酵培养物(包括液体或固体培养物)，按(1 2) (1 2) (1 2)的重量比例，进行混合复配，作为主要杀菌抗菌活性组分；依据现有生物杀菌剂技术，添加适宜辅料、助剂、溶剂或/和，加工为不同剂型的复合生防制剂。本发明所涉及用量比例或百分比，除特别标明外，均为重量比或重量百分比。经室内和大田试验确认，本发明复合生防制剂，可应用于防治水稻根线虫、纹枯病、晚疫病、蔬菜灰霉病、蕃茄病毒病、黄瓜白粉病、靶斑病、大姜姜瘟病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、全蚀病、根腐病、棉花枯萎病、苹果轮纹病、苦痘病、桃树根癌病、柑橘黄龙病、石榴枯萎病、山杨根腐病等多种植物病害。本发明复合生防制剂主要活性组分既含有具有抗菌活性的组织提取液，又含有抗菌微生物，两者具有增效作用，对病原微生物有较强的抑制作用，抑菌同时又能诱导植物自身产生抗性来控制病害。本发明复合生防制剂的自筛菌种MDCGTH 18具有生长速度快，菌丝粗大，子囊壳黑色，育菌周期短等特点，使其产业化更加方便、容易。实验证明，本发明复合生防制剂在非选择压力下连续培养十代，抗药稳定性不变，该性状说明其目的基因表达非常稳定，有利于这一菌剂应用于植物病害的综合防治的实践中；大田实验表明，采用本发明复合生防制剂能持续控制晚疫病，提高生防效果，保护环境。将优良菌株的定殖能力、代谢产物、诱导杭病作用以及对植物促生作用有机地接合起来。本发明复合生防制剂在植物病害的生物防治中具有持续有效、防治效果好、无污染、对人畜安全、无残留、特异性强等优点，且有利于保护环境、保持生态平衡。
具体实施例方式
实施例1.臭椿、夹竹桃不同部位组织提取液杀线虫活性试验对比分别对臭椿皮、叶以及夹竹桃的花、叶、皮部位组织液进行提取，分别向不同提取液中，接入线虫，24h后统计线虫的存活情况，统计线虫的存活数、死亡数，计算死亡率，线虫在植物提取液中24h平均死亡率0 10.0%者，测定结果用“一”表示；死亡率在10. 30.0%者，测定结果用“ + ”表示；死亡率在30. 50.0%者，测定结果用“++”表示；死亡率在50. 1<% 80.0%者，测定结果用“+++”表示；死亡率在80. 100%者，测定结果用 “++++” 表示。结果如表1所示表1不同部位提取液的杀线虫效果
权利要求
1.一种复合生防制剂，其特征在于主要活性组分包括臭椿植物组织提取液、夹竹桃植物组织提取液以及哈茨木霉(Trichodermaharzianum)复合菌种MDCGTH 18的发酵培养物。
2.如权利要求1所述的复合生防制剂，其特征在于所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)复合菌种MDCGTH 18已在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期为2009年3月19号，保藏编号为CGMCCN0.四65。
3.如权利要求1所述的复合生防制剂，其特征在于所述主要活性组分的重量用量比例为臭椿提取液夹竹桃提取液哈茨木霉MDCGTH 18发酵培养物=(1 2) (1 2) (1 2)。
4.如权利要求1所述的复合生防制剂，其特征在于所述主要活性组分的优选重量用量比例为臭椿提取液夹竹桃提取液哈茨木霉MDCGTH 18发酵培养物=1:2:1。
5.如权利要求1所述的复合生防制剂的制备方法，其特征在于将臭椿提取液、夹竹桃提取液和哈茨木霉MDCGTH 18液体发酵培养物或固体发酵培养物，按重量比例(1 2) (1 2) (1 2)，进行混合复配，作为主要杀菌抗菌活性组分；加工为不同剂型的复合生防制剂。
6.如权利要求1或5所述的复合生防制剂的制备方法，其特征在于所说的臭椿提取液的制备方法如下①臭椿采集于四月份分别收集选取无虫害、无菌感染、无腐烂的臭椿的叶、皮，洗去浮尘，晾干备用。②烘干将采集到的臭椿叶、皮原料分别置于干燥箱，50°C烘干Mh③粉碎将烘干后的臭椿叶、皮按(50 80) (20 50)重量比例混合，用破碎机粉碎，过20目分样筛，④提取以95%乙醇为提取剂，按每100L乙醇处理6kg干燥臭椿粉的配料比例，将臭椿叶、皮混合粉末投入预热至50°C的提取剂乙醇中，搅拌均勻并自然冷却至25°C，然后在 300r/min搅拌下，浸泡提取M小时。⑤过滤过滤除去固体残渣，所得提取液用于复配。
7.如权利要求1或5所述的复合生防制剂的制备方法，其特征在于所说的夹竹桃提取液制备方法如下①夹竹桃采集分别收集选取无虫害、无菌感染、无腐烂的夹竹桃的花、叶、皮，洗去浮尘，晾干备用。②烘干将采集到的夹竹桃的花、叶、皮分别置于干燥箱，于50°C烘干Mh。③粉碎将烘干后的夹竹桃的花、叶、皮按(40 50) (30 40) (20 30)重量比例混合，用破碎机粉碎，过20目分样筛。④提取以95%乙醇为提取剂，按每100L乙醇处理6kg干燥夹竹桃粉的配料比例，将夹竹桃的花、叶、皮混合粉末投入预热至50°C的提取剂乙醇中，搅拌均勻并自然冷却至 25°C，然后在300r/min搅拌下，浸泡提取M小时。⑤过滤过滤除去固体残渣，所得提取液用于复配。
8.如权利要求1或5所述的复合生防制剂的制备方法，其特征在于所说的哈茨木霉MDCGTH 18发酵培养物的制备方法如下①斜面培养采用固体PDA培养基，将哈茨木霉MDCGTH18返回菌种接种在试管培养基上，28°C培养2 3天。②茄瓶培养采用液体PD培养基，将试管菌种接种在茄瓶液体培养基中，置于摇床上振荡培养3 4天。③液体菌种培养物采用种子培养基，玉米粉2%，葡萄糖0. 5 %，豆饼粉1 %，磷酸氢二钾0.2%，磷酸二氢钾0.3%，碳酸钙1%，pH 6.0，在121°C灭菌40min，将1 2个茄瓶的种子用无菌水洗下，接种于150立升的种子罐内，30°C培养，通气量1 0.6 0.8，搅拌速度为200r/min，培养时间为36 48h。④固体菌种培养物采用固体培养基，麸皮稻壳玉米粉=7 1 2，含水量为 70 %，pH6. 0，121°C灭菌40min后，以循环水冷却，在接种器内将液体菌种与固体培养基混合均勻，接种量为5 10%，接种完毕转移到固体培养室内培养，30°C培养，培养时间为5 7天，最终产品菌体密度为IO8 IO9个/g。
9.如权利要求1所述的复合生防制剂的应用，其特征在可用于防治水稻根线虫、纹枯病、晚疫病、蔬菜灰霉病、蕃茄病毒病、黄瓜白粉病、靶斑病、大姜姜瘟病、西瓜枯萎病、烟草青枯病、小麦赤霉病、全蚀病、根腐病、棉花枯萎病、苹果轮纹病、苦痘病、桃树根癌病、柑橘黄龙病、石榴枯萎病、山杨根腐病。
全文摘要
本发明为一种复合生防制剂及其应用，涉及植物组织液的提取与自筛菌种的复配技术。本发明使用的自筛菌种MDCGTH18登记编号为CGMCC NO.2965。臭椿叶、夹竹桃花提取液与该菌株经复配后，能有效抑制多种病菌的繁殖，同时能在植物体内诱发防卫反应，使植物本身具有抗病能力，对多种植物病原真菌、细菌及线虫都有很强的抑菌活性，可用于多种植物病害的生物防治，具有抑菌活性强，且抗菌谱广优异效果。
文档编号A01N65/08GK102177921SQ201010516598
公开日2011年9月14日申请日期2010年10月22日优先权日2010年10月22日
发明者于磊娟, 刘冰, 刘和现, 刘旭申请人:刘和现