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Infectious clone construction of jasmine virus C and motif analysis of CP

花匠小妙招
2024-11-10 21:24

摘要：[目的] 构建茉莉C病毒(JaVC)福建分离物基因组全长cDNA侵染性克隆，克隆9省JaVC分离物的CP基因并比较分析基序差异，调查JaVC在我国茉莉产区的分布和传播情况。[方法] 提取JaVC检测呈阳性的茉莉叶片总RNA，以反转录后的cDNA为模板扩增获得JaVC基因组全长序列并构建全长cDNA克隆pXT-JaVC-FJ；同时构建了外壳蛋白(coat protein，CP)融合红色荧光蛋白mCherry的克隆(pXT-JaVC CP-mCherry)。利用农杆菌浸润法侵染本生烟，通过RT-PCR检测法和激光共聚焦扫描显微镜观察法验证JaVC侵染性。克隆其他8省JaVC分离物的3′末端包含CP的片段并测序分析CP基序差异。通过田间调查明确JaVC在茉莉上的发生情况和其传播介体。[结果] pXT-JaVC-FJ浸润本生烟可引起系统侵染，说明该克隆具有侵染活性。所有JaVC分离物的CP均编码296个氨基酸，JaVC中国台湾分离物的CP与各分离物核苷酸序列相似性为82.27%‒91.36%，与广东分离物相似性最高；氨基酸序列相似性为92.23%‒96.82%，与云南分离物相似性最高；各分离物CP的氨基酸序列在32‒35位点上差异显著，具有6种不同的氨基酸基序排列，分别为SEHA、GENA、REGT、SENA、GGDA和GGNA。田间调查显示，JaVC在中国茉莉植株上广泛分布且可在蓟马中检测到JaVC。[结论] 成功构建了JaVC-FJ的侵染性克隆，这为该病毒的基因功能、致病机理等研究奠定了基础；通过我国茉莉产区JaVC的发生及变异情况分析，为JaVC引起的病毒病的防治提供了理论依据。

ZHU Lijuan1 #, ZHANG Chongtao2 #, BAI Yani1 , CHEN Ziyin2 , XIE Xiaoying1 , HAN Yanhong1

Abstract: [Objective] The full-length cDNA infectious clone of jasmine virus C (JaVC), from Fujian Province was constructed. Coat protein (CP) genes of JaVC isolates from 9 provinces/autonomous regions in China were cloned and the motif difference was analyzed. Thereby, the distribution and transmission of JaVC in jasmine producing areas in China were investigated. [Methods] Total RNA of jasmine leaves which tested positive for JaVC was extracted and then reverse-transcribed to cDNA. The cDNA was then used as template for amplification to obtain the full-length genome sequence of JaVC, followed by the construction of full-length cDNA clone pXT-JaVC-FJ and the CP-fused red fluorescent protein mCherry clone pXT-JaVC CP-mCherry. Both of them were then transformed into Agrobacterium tumefaciens for Nicotiana benthamiana infiltration and verified through RT-PCR and confocal laser scanning electron microscopy. Samples collected from eight other provinces/autonomous regions of China positive for JaVC were then used for cloning and sequencing of the 3′ end containing CP. Field investigation was conducted to identify the occurrence and transmission vector of JaVC. [Results] pXT-JaVC-FJ induced systemic infection on N. benthamiana by agro-infiltration, which demonstrated that it was biologically active. CPs of all isolates encoded 296 amino acids. The CP of isolate from Taiwan of China shared 82.27%–91.36% nucleotide sequences and 92.23%–96.82% amino acid sequences with those of isolates from the 9 provinces/autonomous regions. It showed the highest similarity to that from Guangdong and Yunnan Province at nucleotide level and amino acid level, respectively. The CP from different isolates mainly showed difference at aa 32‒35 and six motif arrangements of SEHA, GENA, REGT, SENA, GGDA, and GGNA were identified. Field investigation suggested that JaVC was widely distributed on jasmine plants and could be detected in thrips. [Conclusion] An infectious clone of JaVC-FJ is developed, which lays a foundation for the study of gene function and pathogenic mechanism of JaVC. The analysis of occurrence and variation of JaVC in indifferent jasmine producing areas in China is helpful for the prevention and control of JaVC diseases.

茉莉[Jasminum sambac (L.) Aiton]属于木犀科(Oleaceae)素馨属(Jasminum)，广泛植栽于亚热带地区，其价值功效多样，不仅可以观赏，还可用来制作茉莉花茶、提炼精油、药用和食用等[1‒2]，但茉莉的生长常受到多种病原物的侵害[3‒9]，尤其普遍受到多种病毒的复合侵染。茉莉C病毒(jasmine virus C，JaVC)是一种香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)病毒，该病毒首次在中国台湾报道(JaVC-TW)[3]，后在意大利黄色花叶症状的素方花(J. officinale)中也发现了该病毒(JaVC-Bari)[4]。茉莉C病毒通常与茉莉T病毒(jasmine virus T，JaVT)[5–7]和茉莉H病毒(jasmine virus H，JaVH)[8–9]复合侵染茉莉，引发茉莉叶片黄化嵌纹病症，对茉莉的产量和质量造成巨大威胁[8]。JaVC是一种正单链RNA病毒，基因组由8 490个核苷酸组成，含有5′帽子和3′多聚腺苷酸尾巴结构，基因组编码6个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，5′和3′非编码区(untranslated region，UTR)分别由71和72个核苷酸组成。ORF1编码复制相关蛋白；ORF2‒4编码一个三重基因块运动蛋白，参与病毒的细胞间运动以及长距离运动；ORF5编码一个参与包装病毒粒子的外壳蛋白(coat protein，CP)；ORF6编码一个富含半胱氨酸的蛋白，功能上认为是一个RNA沉默抑制子[10]。

近年来，通过各种不同的策略，越来越多正链或负链RNA病毒的侵染性互补DNA (complementary DNA，cDNA)克隆被构建，并广泛应用于分子生物学、致病机理以及宿主-病毒-介体之间相互作用的研究[11‒14]。此外，利用cDNA克隆系统还成功构建了病毒诱导的基因沉默载体和基于病毒的表达载体[15‒16]，侵染性克隆的构建推动了动植物病毒研究的快速发展[17‒20]。

大多数植物病毒通过介体昆虫、螨类、线虫、菟丝子和真菌等在植物寄主个体间传播[21]，最主要的传播介体是昆虫[22]。研究报道约80%植物病毒是由昆虫介体分别以非持久性、半持久性和持久性方式进行传播。蚜虫、粉虱、叶蝉、飞虱、蓟马和木虱等昆虫是植物病毒病的主要传播介体[23]。

本研究首次克隆了JaVC福建分离物基因组全长并构建其侵染性cDNA克隆pXT-JaVC-FJ。基于pXT-JaVC-FJ构建了CP融合表达红色荧光蛋白mCherry的pXT-JaVC CP-mCherry，利于更直观地观察病毒在宿主体内的分布。为了明确我国其他茉莉产区JaVC的发生及变异情况，克隆了包括四川、云南、广西、湖南、广东、福建、江苏、山东和吉林共9个地区茉莉叶片中JaVC的CP，分析比对与中国台湾JaVC CP的差异，明确不同地区JaVC的分子变异情况。通过对田间茉莉病毒病的调查，摸清JaVC的普遍性和危害性，寻找传播介体和最可能的传播方式。目前，关于茉莉C病毒的研究报道较少，仅有中国台湾分离物(NC_030926.1)和意大利巴里分离物(OL828237.1)的序列被报道，本文对JaVC的研究为更好地了解该病毒的分子特征以及进化关系提供了理论基础，对进一步研究其致病机制和载体改造具有重大意义。

1 材料与方法 1.1 植物材料、载体和菌株

2016年夏从福建福州、广东普宁、广西横县、江苏宿迁、吉林长春、湖南长沙、四川犍为、云南元江以及山东青州9个地区采摘获得茉莉样品(每个省至少3棵以上，混合)。本生烟(Nicotiana benthamiana)种子由福建农林大学媒介病毒研究中心实验室(以下简称本实验室)保存，培养条件：温度(24±1) ℃，光照16 h，黑暗8 h，湿度50%。双元表达载体pXT由南京农业大学陶小荣教授惠赠[24]；含mCherry基因的质粒由福建农林大学陈栩教授提供。大肠杆菌(Escherichia coli) JM109和农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) GV3101由本实验保存。

1.2 试剂与引物

克隆载体pTOPO-Blunt Simple购自艾德莱生物公司；2×Taq PCR Master Mix购自BBI Life Sciences公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；限制性内切酶购自TaKaRa公司；DNA marker、EasyScript® Reverse Transcriptase反转录酶购自TransGen Biotech公司；高保真酶Phusion® High-Fidelity PCR Kit、Gibson Assmbly Master Mix购自NEW ENGLAND BioLabs (NEB)公司。本研究引物均由福建铂尚生物技术公司合成，检测及扩增JaVC全长的引物设计基于GenBank登录号为NC_030926.1的序列(JaVC-TW)，JaVH检测引物JaVH360F和800R基于NC_055545.1，JaVT检测引物JaVT9234F和9510R基于NC_029051.1 (表 1)。

表 1. 本研究所用引物 Table 1. The primers used in this study

Primers Sequences (5′→3′) Note Carla8198F CGTAGGGCCATGTGTGAATAA Detection of JaVC Carla3R GCGGAAAAATAGTTAAAACAC Detection of JaVC JC001F GATAAACATACTATACCTCATTATAACGC Full-length cDNA clone JC3903R TCGCAGTCATAGTCACTTTGGC Full-length cDNA clone JC3881F GCCAAAGTGACTATGACTGCGA Full-length cDNA clone JC6686R TCAGGAGGTGGTGTAAGTGGC Full-length cDNA clone JC6668F CCAGATGCCACTTACACCACCTC Full-length cDNA clone XTJC001F CATTTCATTTGGAGAGGGATAAACATACTATACCTCATTATAACGC Full-length cDNA clone XTCarla3R GCCATGCCGACCCGGGGCGGAAAAATAGTTAAAACAC Full-length cDNA clone XTmC-F TTCATTTGGAGAGGATGGTGAGCAAGGGCG PCR amplification XTmC-R CCATGCCGACCCGGGGATCTTACTTGTACA PCR amplification JC4476F CGCATAGGGAAGGATGAGGG PCR amplification JC8086F GGAATTTGGAAACGAGGGGGCCCATATCTAGATGAGGTACGAGCTTGAAGT PCR amplification JC8085R TCTTTCGATTTCCGGCCCGATGTGGCC PCR amplification mCL-F GGAATTTGGAAACGAGGGGGCCCTAGTTGTAGTAGTCCTAGTCCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG PCR amplificationn mCL-R TACTTCAAGCTCGTACCTCATCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGC PCR amplification XTJCmC-F CAGAGTCTGATTATGAGGCCTTTGATTCGTCACAGGACC PCR amplification XTJCmC-R ATGCCATGCCGACCCGGGGCGGAAAAATAGTTAAAACAC PCR amplification Car2 ATGAGTTCCACATCGGATGAC PCR amplification JaVH360F GCTGATGCCAAGAACCACTTTG Detection of JaVH JaVH800R ACGAGATTCAGTTACCCAAT Detection of JaVH JaVT9324F AGGACACGGAGAGACATACA Detection of JaVT JaVT9510R CGAAAGCATAACGAGGTTCC Detection of JaVT

1.3 获得JaVC-FJ全基因组序列并构建其侵染性克隆

根据GenBank登录号为NC_030926.1的序列设计引物，利用引物对Carla8198F/Carla3R对福州黄化嵌纹病症的茉莉叶片进行JaVC的检测，并以检测阳性的茉莉叶片RNA为模板扩增JaVC全长。由于JaVC病毒较长，难以一次性扩增到全长，将JaVC福建分离物全基因组分为3个片段进行扩增，相邻片段之间有部分重叠序列。首先，利用热酚法提取福建茉莉病叶总RNA，以此RNA为模板，分别加入3个片段的3′端下游引物反转录，各自合成3个片段的第一链cDNA。然后，以cDNA为模板，利用引物对JC001F/JC3903R、JC3881F/JC6686R和JC6668F/Carla3R扩增获得3个DNA片段A1、A2和A3，产物经胶回收纯化后，分别克隆至pTOPO-Blunt载体获得重组质粒pTOPO-A1、pTOPO-A2和pTOPO-A3，经测序拼接获得JaVC-FJ全基因组序列并提交至GenBank (序列号见表 2)。在A1的5′端和A3的3′端加入部分pXT载体序列，设计特异性引物XTJC001F和XTCarla3R。以重组质粒pTOPO-A1、pTOPO-A2和pTOPO-A3为模板，扩增片段XTA1、A2和XTA3，将纯化的目的片段采用无缝克隆的方法构建至经Stu Ⅰ和BamH Ⅰ线性化的pXT载体上，获得重组质粒pXT-JaVC-FJ，测序正确。

表 2. 本研究提交至GenBank的序列登录号 Table 2. GenBank accession numbers submitted in this study

Isolate Length/bp GenBank No. JaVC-FJ 8 487 MH231174 JaVC-CP3′utr+FJ 1 276 MH389787 JaVC-CP3′utr+GD 1 276 MH389788 JaVC-CP3′utr+GX 1 275 MH389789 JaVC-CP3′utr+HN 1 275 MH389790 JaVC-CP3′utr+JL 1 276 MH389791 JaVC-CP3′utr+JS 1 275 MH389792 JaVC-CP3′utr+SC 1 276 MH389793 JaVC-CP3′utr+SD 1 275 MH389794 JaVC-CP3′utr+YN 1 275 MH389795

1.4 农杆菌浸润(agro-infiltration)本生烟

将上述重组质粒pXT-JaVC-FJ转化农杆菌GV3101，筛选阳性克隆摇菌浸润本生烟[14]。首先挑取含质粒pXT-JaVC-FJ农杆菌单菌落于含有卡那(kanamicin，Kan)和利福平(rifampicin，Rif)双抗性的液体培养基(LB)，28 ℃过夜培养活化；次日将活化菌液以1:100接种于额外添加有2-(N-吗啉基)乙磺酸(2-N-morpholino ethanesulfonic acid，MES)和乙酰丁香酮(acetosyringone，As)的双抗性液体LB，28 ℃培养至OD600 0.6‒1.0；将菌液在室温条件下3 500 r/min离心5 min，弃上清；菌体沉淀中加入适量农杆菌重悬缓冲液，悬浮菌体后，调节OD600至0.6–0.8，室温避光静置4 h以上。最后使用1 mL无菌注射器，吸取混合浸润液，去掉针头后将注射器轻轻抵住叶片背面，稍用力但不使叶片破损，缓慢注射，尽量将叶片注满浸润液，一片叶尽量少于2个针孔，减少对叶片的伤害。

1.5 融合红色荧光蛋白(mCherry) JaVC-FJ侵染性克隆的构建

首先以含mCherry质粒为模板，用引物对XTmC-F/XTmC-R扩增目的片段，扩增产物经胶回收后连接至经Stu Ⅰ和BamH Ⅰ线性化的pXT载体，转化大肠杆菌JM109，菌落聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)筛选阳性克隆获得重组质粒pXT-mCherry，作为阳性对照。以重组质粒pXT-JaVC-FJ为模板，用引物对JC4476F/XTCarla3R扩增3′末端包含CP全长的目的片段，将扩增产物胶回收后连至pTOPO载体获得重组质粒pTOPO-CP，以该质粒为模板，利用引物对JC8086F/JC8085R进行反向PCR，在CP末端加入Apa Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位点，产生重组质粒pTOPO-CP-M。随后以该质粒为模板，利用引物对JC4476F/XTCarla3R扩增获得目的片段，将PCR产物经Stu Ⅰ和Sma Ⅰ酶切后纯化回收，与经相同酶线性化的pXT载体连接，得到阳性克隆pXT-CP-M。以mCherry DNA为模板，利用引物对mCL-F/mCL-R扩增获得含有多肽链DGGPSCSSPSP (linker)的mCherry片段，将其纯化回收后与经Apa Ⅰ和Xba Ⅰ线性化的pXT-CP-M载体连接，得到阳性克隆pXT-CP-mCherry。最后用CP-mCherry融合基因替换JaVC cDNA中的CP片段，以pXT-CP-mCherry质粒为模板，利用引物对XTJCmC-F/XTJCmC-R进行扩增，PCR产物经Stu Ⅰ和Sma Ⅰ酶切后纯化回收与经相同酶线性化的pXT-JaVC-FJ连接，转化大肠杆菌JM109，随后进行菌落PCR鉴定获得阳性质粒pXT-JaVC CP-mCherry (图 1)。

图 1 pXT-JaVC CP-mCherry重组质粒构建策略 Figure 1 Strategy of recombinant plasmid pXT-JaVC CP-mCherry.

将构建成功的pXT-mCherry、pXT-CP-mCherry和pXT-JaVC CP-mCherry 3个重组质粒转入农杆菌GV3101，挑取阳性克隆摇菌浸润本生烟，空载体pXT作为阴性对照(EV)，pXT-mCherry作为阳性对照。从浸润2 d后开始取样，之后每隔2 d取浸润叶制片，在激光共聚焦显微镜下倒置观察细胞内荧光发光情况。

1.6 JaVC九个省分离物CP基因的克隆

采用热酚法[25]提取各省茉莉叶片总RNA，利用引物对Carla8198F/Carla3R通过RT-PCR检测叶片是否含有JaVC，以JaVC检测呈阳性样品的RNA为模板，3′端特异性引物Carla3R通过反转录(reverse transcription，RT)合成第一链cDNA，再以引物对Car2/Carla3R进行PCR扩增，回收纯化PCR产物(CP3′utr+)克隆至pTOPO-Blunt载体，转化大肠杆菌JM109，经菌落PCR鉴定筛选阳性克隆获得重组质粒pTOPO-CP3′utr+-FJ (GD/GX/HN/JS/JL/SC/SD/YN)，送至福州铂尚生物有限公司测序分析并提交至GenBank (序列号见表 2)。

1.7 福州茉莉产区的田间调查

2017年11月对福州市永泰县梧桐镇春光村、椿阳村和坂埕村的茉莉种植基地进行田间调查并采集样品，每个村随机采样15份，共计45份叶片，采用热酚法提取样品总RNA进行反转录酶-聚合酶链锁反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)鉴定病毒发生情况。田间调查时发现每个村的茉莉叶片上均有大量蓟马和白粉虱存在，捕获春光村的蓟马和白粉虱进行JaVC以及已报道的另两种病毒JaVH和JaVT的检测，约每10只为1组，加1 mL TRIzol提取总RNA，取1 μg总RNA为模板，以随机引物进行反转录，随后取1 μL的cDNA用特异性检测引物进行30个循环多重PCR检测。

2 结果与分析 2.1 JaVC-FJ全基因组序列的确定

由于JaVC病毒大于8 kb，一次性扩增全长序列较困难，故采用分段扩增策略获得基因组全长，将JaVC-FJ全基因组分为3个片段进行扩增，相邻片段之间有部分重叠序列。经RT-PCR扩增获得3个目的片段A1、A2和A3，大小分别为3 909、2 809和1 818 bp，如图 2所示。将扩增产物经胶回收纯化后，分别克隆至pTOPO-Blunt载体获得重组质粒pTOPO-A1、pTOPO-A2和pTOPO-A3，每个片段挑取至少3个阳性克隆进行测序，结果通过DNAMAN 10.0软件进行分析对比，保证相同片段每个克隆间的相似性大于99%，并利用DNAMAN软件对其进行拼接，得到全长为8 487 nt的序列。将该序列与JaVC-TW进行相似性比较分析，结果表明两者核苷酸序列相似性为88.5%，将该分离物命名为JaVC-FJ。

图 2 JaVC基因组全长3个片段扩增的结果 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of three amplification products of JaVC. M: marker; lane 1: A1; lane 2: A2; lane 3: A3.

2.2 pXT-JaVC-FJ侵染性的鉴定

将JaVC-FJ基因组cDNA全长构建在含35S启动子的双元载体pXT上进而获得重组克隆pXT-JaVC-FJ，将其转化农杆菌GV3101，获得含pXT-JaVC-FJ质粒的农杆菌。利用农杆菌浸润的方法侵染本生烟，浸润第3天，在侵染叶和系统叶上都未发现明显症状。浸润第5天，经RT-PCR检测，侵染叶和系统叶均可以检测出289 bp的JaVC特异性片段(图 3)，说明构建的pXT-JaVC-FJ具有侵染性，能成功系统侵染本生烟。对系统叶进行病毒序列的再测定，发现与侵染性克隆序列一致，并无变异情况的发生。

图 3 JaVC-FJ侵染性的RT-PCR检测 Figure 3 RT-PCR detection of JaVC-FJ infection. M: marker; lane 1‒2: agro-infiltrated leaves; lane 3‒4: systemic leaves; lane 5: PCR detection of total RNA from agro-infiltrated leaves with genomic DNA removal as control to eliminate plasmid contamination from agrobacterium; lane 6: negative control.

将重组质粒pXT-mCherry、pXT-CP-mCherry和pXT-JaVC CP-mCherry分别转化农杆菌GV3101并侵染本生烟，pXT-mCherry作为阳性对照，空载体pXT作为阴性对照(EV)。侵染2 d后取浸润叶制片，在激光共聚焦显微镜下倒置观察发现EV不表达荧光，而3种插入红色荧光基因mCherry的质粒均能够在本生烟细胞内表达，如图 4所示，且CP可能定位于胞间连丝。后期观察了pXT-JaVC CP-mCherry的系统叶，却并未看到与浸润叶类似的荧光。RT-PCR鉴定系统叶可检测到病毒，却检测不到mCherry基因序列。

图 4 红色荧光蛋白mCherry在烟草中的表达情况 Figure 4 Expression of red fluorescent protein mCherry in N. benthamiana. 100/25 μm: scale bar; white square: a partial zoomed-in view of this part.

2.3 JaVC九个省分离物CP基因的克隆

热酚法提取9个省茉莉叶片总RNA，经RT-PCR检测发现所有样品均含有JaVC (结果未显示)。利用引物对Car2/Carla3R经RT-PCR扩增获得每个省分离物CP3′utr+序列，大小约1 200 bp (图 5)，PCR产物经回收纯化后，克隆到pTOPO载体上，获得重组质粒分别命名为pTOPO-JaVC-CP3′utr+-FJ (GD/GX/HN/JS/JL/SC/SD/YN)。

图 5 JaVC九个省分离物CP3′utr+的PCR扩增 Figure 5 PCR amplification of CP3′utr+from nine provinces. M: marker; lane 1: Fujian; lane 2: Guangdong; lane 3: Guangxi; lane 4: Hunan; lane 5: Jilin; lane 6: Jiangsu; lane 7: Sichuan; lane 8: Shandong; lane 9: Yunnan; lane 10: negative control.

2.4 JaVC分离物CP序列分析

使用DNAMAN 10.0软件拼接获得9个省CP基因，测序结果表明CP基因全长均为891 bp，编码296个氨基酸。将其与JaVC中国台湾分离物的CP基因序列进行对比，核苷酸和氨基酸序列的相似性分别为82.27%‒91.36%和92.23%‒96.82%，核苷酸序列与广东相似性最高，氨基酸序列与云南相似性最高。具体见表 3。

表 3. JaVC九个省分离物CP基因与中国台湾核苷酸序列和氨基酸序列相似性比较 Table 3. Comparison of nucleotide and amino acid sequences between Taiwan of China and isolates from nine other provinces

Isolate FJ GD GX HN JL JS SC SD YN Nucleotide/% 87.77 91.36 82.38 82.27 87.21 82.60 87.32 82.60 86.87 Amino acid/% 95.61 96.28 92.23 92.23 95.95 92.23 95.95 92.23 96.82

利用MEGA-X[26]将JaVC所有已知分离物CP氨基酸进一步比对，发现在32‒35位点上的氨基酸序列差异很大，具体如图 6所示。

图 6 中国台湾分离物与10个分离物CP的氨基酸比对 Figure 6 Amino acids alignments of coat protein between Taiwan of China and other known isolates. Red square: amino acid at residue 32‒35.

中国各分离物这4个位点的氨基酸排列方式共有6种，分别是SEHA (中国台湾)、GENA (福建和广东)、REGT (广西、湖南、江苏和山东)、SENA (吉林)、GGDA (四川)和GGNA (云南)，其中按REGT顺序排列的省最多。意大利巴里分离物与中国各省分离物的主要差异也集中在32‒35基序区，为NAGA (巴里)。

为了进一步研究JaVC分离物CP之间的系统进化关系，利用MEGA X中的最大似然法构建系统进化树，其中bootstrap method循环数为1 000次，小于50%的节点被隐藏。CP基因的核苷酸系统进化树(图 7A)将其分为3组，中国台湾、广东、四川、福建、吉林、云南一组，山东、广西、湖南、江苏一组，意大利巴里一组，氨基酸系统进化树(图 7B)将其分为2组，第一组为中国台湾、广东、四川、福建、吉林、云南，第二组为山东、广西、湖南、江苏、意大利巴里。

图 7 JaVC十一个分离物CP核苷酸(A)和氨基酸(B)序列的系统进化树 Figure 7 Phylogenetic tree analysis on complete nucleotide (A) and amino acid (B) sequences of eleven isolates of JaVC CP.

2.5 JaVC田间调查

通过对来自永泰县梧桐镇3个村子的45份茉莉叶片样品JaVC、JaVT和JaVH三种病毒的RT-PCR检测，统计发现田间取样的45份样品中均同时携带有3种病毒，3种病毒的发生率为100% (表 4)。

表 4. 统计45份样品3种病毒的感染情况 Table 4. To count the infection of three viruses in 45 samples

Samples JaVT JaVC JaVH Village of Chuanguan (1‒15) + + + Village of Chuanyang (1‒15) + + + Village of Bancheng (1‒15) + + +

同时对茉莉上蓟马和白粉虱进行了3种病毒的RT-PCR检测，结果表明，在蓟马中可以检测到JaVC和JaVT两种病毒的存在，在白粉虱中只能检测到JaVT病毒，JaVT和JaVC特异条带大小分别是186 bp和289 bp (图 8)。

图 8 检测蓟马和白粉虱中3种病毒感染情况 Figure 8 Detection of three virus infections in thrips and whiteflies. M: marker; lane 1: thrips; lane 2: whiteflies; lane 3: negative control of thrips; lane 4: negative control of whiteflies.

3 讨论

本研究将JaVC全基因组克隆到含花椰菜花叶病毒双35S启动子的pXT双元载体而获得侵染性克隆pXT-JaVC-FJ，并在其基础上获得融合了红色荧光蛋白的pXT-JaVC-mCherry克隆。通过农杆菌浸润的方法，将构建的pXT-JaVC以及pXT-JaVC CP-mCherry克隆侵染本生烟，侵染第5天时，本生烟的浸润叶和系统叶均可检测到JaVC的基因组且侵染率达到100%。侵染第2天时，在激光扫描显微镜下，可以在侵染叶上观察到红色荧光蛋白，同时RT-PCR可以检测到JaVC和mCherry的基因片段，2个实验结果共同说明了JaVC在烟草中成功表达且具有侵染性。在激光共聚焦显微镜下未观察到系统叶上红色荧光蛋白的表达，RT-PCR也只能够检测到JaVC，检测不到mCherry，猜测在病毒复制过程中，与JaVC相连的mCherry基因发生了丢失。多肽链的长短对融合蛋白的表达和稳定性均有一定的影响[27]，多肽链长度不够可导致红色荧光蛋白在病毒运动的过程中出现不稳定表达。本研究首次成功构建了JaVC-FJ的侵染性克隆，为该病毒的基因功能、致病分子机理等研究奠定了基础，进而为利用基因工程手段进行茉莉上的抗病育种提供了理论依据。

来自9个不同省的茉莉叶片均能检测到JaVC的存在，以及来自福州永泰县梧桐镇3个村子的45份茉莉叶片样品均同时携带有JaVC、JaVT和JaVH三种病毒，说明JaVC在中国的茉莉植株上广泛分布且通常与JaVT和JaVH复合感染茉莉。无论是在核苷酸还是在氨基酸水平上，9个不同省病毒的CP都与JaVC-TW表现出较高的同源性，说明各分离物之间分子差异较小，该病毒尚处于进化的初期，还未出现明显的变异，由此减小了对JaVC致病机制研究的困难，有助于实现病毒的预防和控制。11个JaVC CP的核苷酸序列在32‒35位点的相似性很低，共有7种不同的氨基酸序列排列，推测在该范围发生基因变异的可能性较高，这可能与长期地理隔离有关。并且值得注意的是，氨基酸序列按REGT顺序排列的省最多，包括广西、湖南、江苏和山东4个地区，与进化树分析后的分组情况一致，这说明了该范围的氨基酸序列极有可能是划分JaVC不同分离物的依据。另外该病毒外壳蛋白的氨基酸在90‒270位点区间序列保守性很高，这与Martelli GP等[28]发现香石竹潜隐病毒属的外壳蛋白在160‒260位具有保守氨基酸结构的结果相符合。根据进化树的结论，JaVC CP分成2个分支群体，其中中国台湾、广东、四川、福建、吉林、云南分为一组，山东、广西、湖南、江苏为另一组。若从南北地理位置分析出发，并未找到分组规律，因此考虑到福建茉莉繁殖方式和病毒传播方式，各种植地的茉莉自何处引种也是影响病毒分组的因素。

田间茉莉叶片上发现有大量蓟马和白粉虱的存在，检测结果发现在蓟马中可以检测到JaVC和JaVT两种病毒的存在，在白粉虱中只能检测到JaVT病毒，可初步认为蓟马可传播JaVC，蓟马和白粉虱可传播JaVT，该研究可为茉莉病毒的防治奠定基础。但在田间调查过程中我们发现，茉莉的自然结实率非常低，据韦昌联等[29]报道，茉莉的自然结实率平均只有0.19%，它的繁育方式常以扦插、分株和压条等无性繁殖的方式为主。本实验室在福州永泰的茉莉基地中发现一颗茉莉种子，播种培育后成功长出茉莉植株，RT-PCR检测后发现该植株没有感染这3种病毒，因此我们猜测茉莉上的病毒更可能以无性繁殖的方式进行传播。