首页 > 分享 > 黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用的制作方法

黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用的制作方法

花匠小妙招
2024-11-10 21:36

黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种RNA植物病毒-烟草花叶病毒属（Tobamovirus）的黄瓜绿斑驳花叶病毒（ Cucumber green mottle mosaic virus , CGMMV）侵染性克隆载体制备及携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的致病性分析。黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体，该侵染性克隆载体由黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列融合到带35S启动子和核酶Rz的载体pCB301-CH制备得到，所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列如Seq ID No:12所示。本发明农杆菌菌株可以大量产生黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆；该侵染性克隆只侵染植物，不侵染昆虫，不感染动物和人，相对安全。
【专利说明】黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体和农杆菌菌株及其制备方法和应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种RNA植物病毒-烟草花叶病毒属（Tobamovirus)的黄瓜绿斑驳花叶病毒mosaic Firw1S, CGMMV)侵染性克隆载体制备及携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的致病性分析。

【背景技术】
[0002] 黄瓜绿斑驳花叶病毒属于芜菁花叶病毒科（Tymoviridae)烟草花叶病毒属 (genus TbAaffiorirw1S)成员，其病毒粒子形态为杆状，病毒基因组约为6. 4kb，包括5' -及 3' -端非编码区和4个开放性的阅读框，分别编码129kDa和186kDa复制相关蛋白、29kDa 的移动蛋白及17. 4kDa的外壳蛋白。该病毒严重威胁着瓢瓜（Zageaaria siceraria)、西瓜 {Citrullus Ianatu^)、激瓜 iCucumis melo)、贵瓜 iCucumis sativus Linn.')等银芦琴(饮· 物的生产，是世界上许多国家和地区葫芦科植物上的重要检疫性病毒。其传播主要是通过带毒种子远距离传播，介体、汁液和被病残体污染的土壤等也能传毒。目前在我国广西、辽宁、北京、河北、甘肃、山东、湖南、上海等多个地区均检测到CGMMV的发生，并呈扩展蔓延趋势，对葫芦科蔬菜和瓜果的生产造成重要经济损失。
[0003] 植物病毒侵染性克隆的获得是研究病毒基因功能的前提，运用构建的侵染性克隆很容易通过基因交换、突变、缺失、插入、重组等实验来分析病毒基因的功能，鉴定病毒基因在侵染植株中产生的效应。1983年首次在雀麦花叶病毒η>?5·，BMV)中获得第一例有侵染活性的植物RNA病毒cDNA克隆。随后该技术迅速发展，目前主要构建策略有携带T7、SP6或T3等原核启动子控制的侵染性克隆和由花椰菜花叶病毒 mosaic CaMV) 35S启动子控制的侵染性克隆两种。本发明在获得黄瓜绿斑驳花叶病毒基因组全序列的基础上，构建了该病毒的侵染性克隆。将包含35S启动子的黄瓜绿斑驳花叶病毒cDNA序列构建入双元载体pCB301-CH中，通过农杆菌介导转化后在寄主体内转录、复制、侵染，以用于病毒的功能基因组研究。

【发明内容】

[0004] 为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cl/camfer mosaic CGMMV)的侵染性克隆载体及其制备方法,本发明的第二个目的是提供携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株及其应用。
[0005] 为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：黄瓜绿斑驳花叶病毒（Ci/cttwAer mosaic Firw1S, CGMMV)的侵染性克隆载体，该侵染性克隆载体由黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列融合到带35S启动子和核酶 Rz的载体PCB301-CH制备得到，所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列如Seq ID No: 12 所示。
[0006] 上述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，该方法包括以下的步骤： 1) 获得黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列； 2) 设计引物 pCass-CH-CGMMV(+)， pCass-CH-CGMMV (-)， CGMMV3145(+)和引物 CGMMV3145 (-);分别以引物对 pCass-CH-CGMMV (+) /CGMMV3145 (-)和引物对 CGMMV3145 (+) / pCass-CH-CGMMV (-)分两段扩增 CGMMV 全序列；所述的引物 pCass-CH-CGMMV (+)， pCass-CH-CGMMV (-)，CGMMV3145 (+)和引物 CGMMV3145 (-)的基因序列分别为 Seq ID No:10, Seq ID No:11, Seq ID No:8, Seq ID No:9 ； 3) 将纯化的扩增目的片段与经Stu I和Sma I双酶切的pCB301-CH载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出具有正确CGMMV 基因组全序列的克隆； 4) 提取包含CGMMV全长质粒的克隆，获得黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体 pCB301-CGMMV。
[0007] 作为优选，所述的步骤1)中黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列获得包括以下的步骤： I. 1)植物总RNA的提取：采用Trizol法提取病叶的总RNA ; I. 2)CGMMV 5'-末端和3'-末端序列的扩增：根据GenBank上发表的CGMMV基因组全序列，GenBank登录号NC_001801，设计引物CGMMV 682(-)、CGMMV 1218(-)和CGMMV CP(+)，引物分别为369 10吣：1、569 10吣:2和569 10吣:3，以3六?/^6丽￥〇卩(+)为引物进行 3' -RACE，获得完整3' -末端序列；5' -末端序列的获得首先以5AP/CGMMV 1218 (-)进行第一轮扩增，然后以该PCR扩增产物为模板，以5AP/CGMMV 682(-)为引物做巢式PCR进行第二轮扩增，获得完整5' -末端序列； 1. 3)经5' -RACE和3' -RACE确定了 CGMMV分离物的5' -末端和3' -末端的序列后，设计引物06丽￥〇)厘(+)、〇6丽￥2251 (+)、〇6丽￥3526(-)和〇6丽￥〇)厘(-)，序列分别为569 10 No:4、Seq ID No:6、Seq ID No:5 和 Seq ID No:7;以引物对 CGMMVC0M(+)/CGMMV3526(_) 和CGMMV2251 (+) /CGMMV COM(-)分两段扩增CGMMV序列；扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得CGMMV的全序列。
[0008] 作为优选，所述的步骤I. 3)PCR扩增体系为：9μ L DEPC水、25μ L 2X PCR Buffer for KOD FX NeoUOyL 2 mM dNTPs、上下游引物（ΙΟμΜ)各 1.5yL、2yL cDNA模板、1 μ L K0D-FX-NE0聚合酶，总反应体系为50 μ L ;各片段的反应条件为：94 °C 2min; 94 °C 15 s, 6(TC 30 s, 68 °C 3.5min, 35 个循环；68 °C lOmin。
[0009] 作为优选，所述的步骤3)中重组反采用IOyL体系反应，其中5 X CE MultiS Buffer 2yL，StuI和Sma I双酶切线性化克隆载体pCB301-CH 120ng，片段 P35SCGMMV3164 60ng，片段pCGMMV3145-RZ 66ng，Exnase?MultiS Ιμ?,最后用 ddH20,调整体系至10 μ L。
[0010] 为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，该农杆菌菌株由权利要求1所述的导入到农杆菌菌株ΕΗΑ105获得。
[0011] 上述的携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的应用，该应用用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。
[0012] 本发明与现有技术比较具有以下优势： 1、提供的农杆菌菌株可以大量产生黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆； 2、该侵染性克隆只侵染植物，不侵染昆虫，也不感染动物和人，相对安全； 3、利用发明提供的侵染性克隆能高效侵染多种葫芦科、茄科植物，操作简单，重复性好； 4、利用本发明提供的侵染性克隆可有效用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的致病性分析。

【专利附图】

【附图说明】
[0013] 图1表达载体pCB301-CGMMV扩增构建示意图。
[0014] 图2 pCB301-CGMMV接种本氏烟、瓠瓜、西瓜和黄瓜后系统叶的症状表现；a: PCB301-CGMMV接种本氏烟10天后症状；b: pCB301-CGMMV接种瓠瓜10天后症状；c: PCB301-CGMMV接种西瓜10天后症状；d: pCB301-CGMMV接种黄瓜20天后症状。
[0015] 图3 pCB301-CGMMV接种本氏烟、瓠瓜、西瓜和黄瓜后的Dot-ELISA检测结果。
[0016] 图4 pCB301-CGMMV接种本氏烟、瓠瓜、西瓜和黄瓜后的PCR检测结果；M :Trans2K Plus DNA Marker ;1 :阳性对照；2 :阴性对照；3 :本氏烟；4 :瓢瓜；5 :西瓜；6 :黄瓜。

【具体实施方式】
[0017] 本发明所提供的实施例均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。
[0018] 表I CGMMV 5' -RACE、3' -RACE及全序列扩增引物

【权利要求】
1. 黄瓜绿斑驳花叶病毒（gree/? mosaic Firys，CGMMV)的侵染性克隆载体，其特征在于：该侵染性克隆载体由黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列融合到带35S 启动子和核酶Rz的载体PCB301-CH制备得到，所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列如 Seq ID No: 12 所示。
2. 携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株，其特征在于：该农杆菌菌株由权利要求1所述的导入到农杆菌菌株EHA105获得。
3. 根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤： 1) 获得黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列； 2) 设计引物 pCass-CH-CGMMV(+)，pCass-CH-CGMMV (-)，CGMMV：3145(+)和引物 CGMMV3145 (-);分别以引物对 pCass-CH-CGMMV (+) /CGMMV3145 (-)和引物对 CGMMV3145 (+) / pCass-CH-CGMMV (-)分两段扩增 CGMMV 全序列；所述的引物 pCass-CH-CGMMV (+)， pCass-CH-CGMMV (-)，CGMMV3145 (+)和引物 CGMMV3145 (-)的基因序列分别为 Seq ID No:10, Seq ID No:11, Seq ID No:8, Seq ID No:9 ； 3) 将纯化的扩增目的片段与经Stu I和Sma I双酶切的pCB301-CH载体进行重组反应，然后将连接产物转入大肠杆菌，挑选具有全长插入的克隆，测序筛选出具有正确CGMMV 基因组全序列的克隆； 4) 提取包含CGMMV全长质粒的克隆，获得黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体 pCB301-CGMMV。
4. 根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤1)中黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV全序列获得包括以下的步骤： 1. 1)植物总RNA的提取：采用Trizol法提取病叶的总RNA ; 1. 2)CGMMV 5'-末端和3'-末端序列的扩增：根据GenBank上发表的CGMMV基因组全序列，GenBank登录号NC_001801，设计引物CGMMV 682(-)、CGMMV 1218(-)和CGMMV CP(+)，引物分别为 Seq ID No: 1、Seq ID No:2 和 Seq ID No:3,以 3AP/CGMMV CP(+)为引物进行 3' -RACE，获得完整3' -末端序列；5' -末端序列的获得首先以5AP/CGMMV 1218 (-)进行第一轮扩增，然后以该PCR扩增产物为模板，以5AP/CGMMV 682(-)为引物做巢式PCR进行第二轮扩增，获得完整5' -末端序列； 1. 3)经5' -RACE和3' -RACE确定了 CGMMV分离物的5' -末端和3' -末端的序列后，设计引物〇6丽￥〇)1(+)、〇6丽￥2251 (+)、〇6丽￥3526(-)和〇6丽￥〇)1(-)，序列分别为569 10 No:4、Seq ID No:6、Seq ID No:5 和 Seq ID No:7;以引物对 CGMMVC0M(+)/CGMMV3526(_) 和CGMMV2251 (+) /CGMMV COM(-)分两段扩增CGMMV序列；扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得CGMMV的全序列。
5. 根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤 1.3)PCR 扩增体系为：9iiL DEPC 水、25iiL 2X PCR Buffer for KOD FX Neo、 10 ii L 2 mM dNTPs、上下游引物（10 ii M)各 1. 5 ii L、2 ii L cDNA 模板、1 ii L KOD-FX-NEO 聚合酶，总反应体系为50iiL;各片段的反应条件为：94 °C 2min; 94 °C 15 s，60°C 30 s， 68 °C 3.5min, 35 个循环；68 °C lOmin。
6. 根据权利要求1所述的黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染性克隆载体的制备方法，其特征在于：步骤3)中重组反采用lOiiL体系反应，其中5 X CE MultiS Buffer 2iiL， StuI和Sma I双酶切线性化克隆载体pCB301-CH 120ng，片段p35SCGMMV3164 60ng，片段 PCGMMV3145-RZ 66ng，Exnase? MultiS 1 ii 1，最后用 ddH20 调整体系至 10 ii L。
7.权利要求2所述的携带黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染性克隆的农杆菌菌株的应用，其特征在于该应用用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的致病性分析、病毒基因功能研究。
【文档编号】C12N1/21GK104498521SQ201410706857
【公开日】2015年4月8日申请日期:2014年11月27日优先权日:2014年11月27日
【发明者】燕飞, 郑红英, 肖彩利, 韩科雷, 鲁宇文, 林林, 陈剑平申请人:浙江省农业科学院