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植物抗花叶病毒相关蛋白RSMV7及其编码基因和应用.pdf

花匠小妙招
2024-11-06 02:09

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410497077.4 (22)申请日 2014.09.23 (65)同一申请的已公布的文献号申请公布号 CN 104262472 A (43)申请公布日 2015.01.07 (73)专利权人东北师范大学地址 130024 吉林省长春市人民大街5268 号，东北师范大学生命科学学院遗传与细胞研究所，综合实验楼515室专利权人吉林省农业科学院 (72)发明人庞劲松贺红利杨向东郭东全杨静张伟邢国杰蔡琴安钱雪艳姚瑶董英山李启云刘宝 (74)专利代理机构北京。

2、纪凯知识产权代理有限公司 11245 代理人关畅何叶喧 (51)Int.Cl. C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (56)对比文件 CN 101766187 A,2010.07.07,全文. WO 2014004983 A1,2014.01.03,全文. WANG Bang-Jun et al.Cloning and Analysis of a Disease Resistance Gene Homolog from Soybean. Acta Botanica S。

3、inica .2013,第45卷(第7期),摘要，第865页右栏第4段-第866页左栏第2段，第868页右栏第1 段. Wang,B. et al. “Accession NO： NP_ 001235720， resistance protein KR3 Glycine max” . GENEBANK DATABASE .2014,FEATURES和 ORIGIN部分. Wang,B. et al. “Accession NO： NP_ 001235720， resistance protein KR3 Glycine max” . GENEBANK DATABASE .2014,FEA。

4、TURES和 ORIGIN部分. 审查员刘婷 (54)发明名称植物抗花叶病毒相关蛋白RSMV7及其编码基因和应用 (57)摘要本发明公开了一种植物抗花叶病毒相关蛋白RSMV7及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为RSMV7蛋白，是如下(a)或(b)： (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗花叶病毒病相关的由序列1衍生的蛋白质。编码所述RSMV7蛋白的基因(命名为RSMV7基因)也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述R。

5、SMV7基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒病的抗性高于所述目的植物的转基因植物。本发明对于培育抗植物花叶病毒病的转基因植物具有重大的应用价值。权利要求书1页说明书8页序列表7页附图1页 CN 104262472 B 2017.05.10 CN 104262472 B 1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。 2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。 3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)的DNA分子： (1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子； (2)序列表的序列3所示的DNA分子。 4.含有权利要求2或3所述。

6、基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。 5.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒病的抗性高于所述目的植物的转基因植物。 6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。 7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒的抗性高于所述目的植物的转基因植物。 8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。 9.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体在培育对植物花叶。

7、病毒病的抗性增高的转基因植物中的应用。 10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述转基因植物的出发植物为单子叶植物或双子叶植物。 11.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述基因或权利要求4所述重组载体在培育对植物花叶病毒的抗性增高的转基因植物中的应用。 12.如权利要求11所述的应用，其特征在于：所述转基因植物的出发植物为单子叶植物或双子叶植物。权利要求书 1/1 页 2 CN 104262472 B 2 植物抗花叶病毒相关蛋白RSMV7及其编码基因和应用技术领域 0001 本发明涉及一种植物抗花叶病毒相关蛋白RSMV7及其编码基因和应用。背景技。

8、术 0002 大豆花叶病毒病是由大豆花叶病毒(Potyviridae， Soybean Mosaic Virus， SMV) 引起的世界性病害,它严重影响大豆产量和品质。大豆花叶病毒从病毒分类学上属于马铃薯Y病毒科，是马铃薯病毒属的一个种。马铃薯病毒属成员的共同点是种子带毒，蚜虫为主要传毒介体。大豆花叶病毒病危害重、流行广，难以控制。该病于1899年首次在中国东北发现，相继又在美国、朝鲜、德国、苏联等国家发现。 1978年中国皖北阜阳地区大豆花叶病猖獗， 150万亩大豆绝产。近年来该病在中国东北地区发生越来越严重，一般流行年造成减产 25-60，大流行年可。

9、造成绝产。大豆花叶病毒病不但影响大豆的产量，还影响大豆的种子质量，可造成病株籽粒出现褐斑，严重时病籽粒率高达50以上，严重降低大豆的商品价值。 0003 SMV的体外保毒期在环境为室温、 4和0以下分别为4-5天、 15天和120天左右。 SMV的致死温度为58-66，稀释限点为10-5。 SMV可以通过种子在上下代和不同地域之间传播，在田间又可通过汁液摩擦接种及蚜虫进行非持久性传播。 0004 大豆花叶病毒在植株上的症状主要分花叶和坏死两大类。花叶类症状表现为感染初期嫩叶上出现明脉，随着病程的发展，陆续出现轻花叶、花叶、黄斑花叶、叶片向下反卷，有些还出现疱。

10、叶、畸形叶、皱缩、矮化、增厚发脆，茎杆和豆荚上的茸毛消失，产生 “光荚” 。坏死型症状主要表现为感染初期叶片上出现褐色小枯斑或叶脉坏死，随后坏死部分扩大甚至连成一片，严重者导致叶片脱落。某些品种感染特定株系后，主茎生长点坏死，形成所谓的 “顶枯” 。 0005 被大豆花叶病毒侵染的植株，其籽粒的种皮上会产生褐色或黑色的斑纹，即褐斑粒。斑纹的发生受大豆品种和发病程度的影响。大豆花叶病毒病在籽粒上形成的斑纹颜色与脐色一致或稍深，有时斑纹会遍布整个籽粒表面，多数呈现放射性或带状。吴宗璞将斑驳按颜色划分为淡褐斑、深褐斑、赤褐斑、紫褐斑、黑色斑、。

11、灰兰斑和双色斑7种；按形状分为河川状、轮纹状、放射状、不规则斑块状、花斑和脐一侧双条带斑6种。发明内容 0006 本发明的目的是提供一种植物抗花叶病毒相关蛋白RSMV7及其编码基因和应用。 0007 本发明提供的蛋白质，来自大豆，命名为RSMV7蛋白，是如下(a)或(b)： (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗花叶病毒病相关的由序列1衍生的蛋白质。 0008 为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接。

12、上如表1所示的标签。说明书 1/8 页 3 CN 104262472 B 3 0009 表1标签的序列 0010 标签残基序列 Poly-Arg5-6(通常为5个)RRRRR Poly-His2-10(通常为6个)HHHHHH FLAG8DYKDDDDK Strep-tag II8WSHPQFEK c-myc10EQKLISEEDL 0011 上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5 端和/或3。

13、端连上表1所示的标签的编码序列得到。 0012 编码所述RSMV7蛋白的基因(命名为RSMV7基因)也属于本发明的保护范围。 0013 所述基因具体可为如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子： 0014 (1)编码区如序列表的序列2所示的DNA分子(开放阅读框)； 0015 (2)序列表的序列3所示的DNA分子(基因组DNA)； 0016 (3)在严格条件下与(1)或(2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗花叶病毒病相关蛋白的DNA分子； 0017 (4)与(1)或(2)限定的DNA序列至少具有90以上同一性且编码植物抗花叶病毒病相关蛋白的DNA分子。 0018 上述严格条件可为。

14、： 50，在7SDS、 0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65， 0.1SSC， 0.1SDS中漂洗。上述严格条件也可为：在6SSC， 0.5SDS的溶液中，在65下杂交,然后用2SSC,0.1SDS和1SSC,0.1SDS各洗膜一次。 0019 含有所述RSMV7基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。 0020 可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3 端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的 DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到。

15、mRNA前体的3 端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于进行鉴定及筛选，可对所述重组表达载体进行加工，如加入编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂。

16、标记基因等。 0021 所述重组表达载体具体可为将所述RSMV7基因插入pB7RWG2载体的重组位点之间得到的重组质粒pB7RWG2-7R。 0022 所述重组质粒pB7RWG2-7R的构建方法具体如下：合成序列表的序列2所示的双链DNA分子；以步骤合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩说明书 2/8 页 4 CN 104262472 B 4 增，得到PCR扩增产物；步骤的PCR扩增产物与pDONOR221载体发生BP重组反应，得到中间质粒；中间质粒与pB7RWG2载体发生LR重组反应，得到重组质粒pB7RWG2-7R，重组质粒 pB7RW。

17、G2-7R中， attB1位点和attB2位点之间为序列表的序列2所示的双链DNA分子； F1： 5 - GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTAAAACATGTTCC-3； R1： 5 - GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTATTCCAAGTCGCGTAT-3 。 0023 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述RSMV7基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒病的抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述RSMV7基因具体可通过所述重组表达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质。

18、粒、 Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述RSMV7基因具体可通过所述重组质粒pB7RWG2-7R导入所述目的植物中。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，如大豆品种JACK。所述植物花叶病毒病具体可为由大豆花叶病毒强毒3号株系引起的植物花叶病毒病。 0024 本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述RSMV7基因导入目的植物中，得到对植物花叶病毒的抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述RSMV7基因具体可通过所述重组表。

19、达载体导入所述目的植物。所述方法中，所述重组表达载体可通过使用Ti质粒、 Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。所述RSMV7基因具体可通过所述重组质粒pB7RWG2-7R导入所述目的植物中。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，如大豆品种JACK。所述植物花叶病毒具体可为由大豆花叶病毒强毒3号株系。 0025 本发明还保护所述RSMV7蛋白、所述RSMV7基因或所述重组载体在培育对植物花叶病毒病的抗性增高的转基因植物中的应用。所述。

20、植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，如大豆品种JACK。所述植物花叶病毒病具体可为由大豆花叶病毒强毒3号株系引起的植物花叶病毒病。 0026 本发明还保护所述RSMV7蛋白、所述RSMV7基因或所述重组载体在培育对植物花叶病毒的抗性增高的转基因植物中的应用。所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆，如大豆品种JACK。所述植物花叶病毒具体可为大豆花叶病毒强毒3号株系。 0027 本发明对于培育抗植物花叶病毒病的转基因植物具有重大的应用价值。附图说明 0028 图1为对两个转基因株系(B2H5040和B2H5048)的。

21、T2代植株进行PCR鉴定的部分结果。 0029 图2为T1代转基因大豆的抗病鉴定结果， A为苗期， B为花期。 0030 图3为T2代转基因大豆的抗病鉴定结果(花期)。具体实施方式 0031 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验说明书 3/8 页 5 CN 104262472 B 5 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 0032pDONOR221载体：为Invitrogen公司 “Multisit。

22、ePro Plus Kit for 2-, 3-or 4-fragment recombination” 试剂盒中的组件， Cat.#12537-100。 0033 pB7RWG2载体： Plant system biolgo， http:/gateway.psb.ugent.be/vector/ show/pB7RWG2/search/index/。 0034 农杆菌EHA101：参考文献： Regeneration Study of Soybean Cultivars and Their Susceptibility to Agrobacterium tumifaciens EHA 10。

23、1.Acta Agron Sin, 2003,29(5):664-669.。 0035 大豆品种JACK(野生型植株)：国家作物种质资源数据库( query/croplist.php)，种质资源编号为WDD01579。 0036 大豆花叶病毒强毒3号株系(SMV3号株系)：参考文献：郑翠明,常汝镇,邱丽娟,吴宗璞,高凤兰.大豆种质资源对SMV3号株系的抗性鉴定.大豆科学,2000,19(4):299-306.。 0037 实施例中所用到的各个培养基的配方见表2。 MS合成盐购自Sigma公司，货号为 M5524。 B5合成盐购自Sigma公司，货号为G5768。 0038 表2 。

24、培养基配方 0039 说明书 4/8 页 6 CN 104262472 B 6 0040 0041 实施例1、 RSMV7蛋白及其编码基因的发现 0042 将中黄35(大豆花叶病毒病抗病品种)和九农9号(大豆花叶病毒病感病品种)分别播种于装有灭菌土的纸杯中，放入光照培养箱中培养，每天光照16小时，黑暗8小时，温度25 。每个品种分为两组，实验组在第一片三出复叶摩擦接种大豆花叶病毒，对照组不接种大豆花叶病毒。感病品种实验组叶片出现轻微花叶时，进行取材，取材部位为刚发病的叶片，对照组取与其对应位置的叶片。这样共得到四个样本。 0043 从各个样本中提取RNA并进行芯片杂。

25、交，筛选出各组合比较表达差异在2倍以上的基因片段。在此基础上依次获取全长基因并验证功能。 0044 进行大量验证试验，发现一个蛋白，如序列表的序列1所示，将其命名为RSMV7蛋白。将编码RSMV7蛋白的基因命名为RSMV7基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示，其基因组DNA如序列表的序列3所示(序列表的序列3中，自5 末端第163-626位核苷酸、第768- 1890位核苷酸和第1999-2250位核苷酸为外显子)。 0045 实施例2、应用RSMV7基因培育抗病大豆 0046 一、重组质粒的构建 0047 1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。 004。

26、8 2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。 0049 F1： 5 -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTAAAACATGTTCC-3 ； 0050 R1： 5 -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTATTCCAAGTCGCGTAT-3 。说明书 5/8 页 7 CN 104262472 B 7 0051 F1中的下划线标注attB1位点， R1中的下划线标注attB2位点。 0052 3、步骤2的PCR扩增产物与pDONOR221载体发生BP重组反。

27、应，得到中间质粒。 0053 4、中间质粒与pB7RWG2载体发生LR重组反应，得到重组质粒pB7RWG2-7R。重组质粒 pB7RWG2-7R中， attB1位点和attB2位点之间为序列表的序列2所示的双链DNA分子。 0054 二、转基因植物的获得 0055 1、将重组质粒pB7RWG2-7R导入农杆菌EHA101，得到重组农杆菌。 0056 2、用CCM液体培养基悬浮重组农杆菌，得到OD600nm0.50.8的菌悬液。 0057 3、取大豆品种JACK的种子，在含有氯气的密闭容器中灭菌12-16个小时。 0058 4、完成步骤3后，取种子，种脐朝下置于GM培。

28、养基平板上， 23暗培养24小时。 0059 5、完成步骤4后，取种子，用无菌解剖刀沿种脐切开，并去掉腋芽，在腋芽上方凹槽处平行于中轴划34个切口，然后置于步骤2得到的菌悬液中浸泡3040分钟。 0060 6、完成步骤5后，将种子移至铺有无菌滤纸的CCM培养基平板上， 23暗培养45 天。 0061 7、完成步骤6后，将种子转移至SIM培养基平板上， 25、 16h(光)/8h(暗)培养，每2 3周继代1次，共继代培养35次。 0062 8、完成步骤7后，将诱导出丛生芽的外植体上的子叶切去，置于SEM培养基平板上， 25、 16h(光)/8h(暗)培养，每23。

29、周继代1次，共继代培养23次，继代时去掉褐化的愈伤组织。 0063 9、完成步骤8后，当再生芽生长至48cm时，将再生芽切下后转移至RM培养基平板上， 25、 16h(光)/8h(暗)培养。 0064 10、完成步骤9后，当再生植株长出2条以上的根，移至炼苗室驯化35天，然后转移至温室中生长，得到T0代植株。 0065 11、 T0代植株单株自交，获得T1代植株。 0066 12、将T0代植株和T1代植株分别进行PCR鉴定，方法如下：提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约1.8kb的扩增产物，鉴。

30、定结果为阳性。 0067 F2： 5 -ATGGCTAAAACATGTTCCGGTGCAT-3 ； 0068 R2： 5 -CTATTCCAAGTCGCGTATGGCAAG-3 。 0069 13、 T1代植株单株自交，获得T2代植株。 0070 14、取T2代植株，按照步骤12的方法进行PCR鉴定。 0071 对于某一T1代植株来说，如果该植株与其T2代植株均为鉴定阳性，该T1代植株为纯合的转基因植株，该植株及其自交后代为转基因株系。 0072 两个转基因株系(B2H5040和B2H5048)的T2代植株进行PCR鉴定的部分结果见图1 (WT代表野生型植株， CK代表作为阳性。

31、对照的重组质粒pB7RWG2-7R)。 0073 三、空载体质粒的获得 0074 pB7RWG2载体中有自杀基因ccdB，它在普通原核细菌(包括大肠杆菌和农杆菌)中表达出致死蛋白杀死宿主，只有在特殊菌株才能正常存活，所以不能将它导入农杆菌用于转化植物，而是必须去掉ccdB基因之后才可以作为空载体质粒。 0075用限制性内切酶Bsp1407I(Fermentas)酶切pB7RWG2载体，回收大说明书 6/8 页 8 CN 104262472 B 8 片段，用T4连接酶连接，得到空载体质粒。 0076 四、转空载体植物的获得 0077 用空载体质粒代替重组质粒pB7RWG2。

32、-7R，其它同步骤二，得到转空载体植株。 0078 五、转基因植物的鉴定 0079 分别将两个转基因株系(B2H5040和B2H5048)的T1代植株和T2代植株，转空载体植株的T1代植株和T2代植株，大豆品种JACK，进行大豆花叶病毒抗性鉴定，每个株系对20株T1 代植株进行鉴定，每个株系对60株T2代植株进行鉴定，方法如下： 0080 在大豆苗期(第一片复叶展开)，采用田间人工摩擦接种的方法接种大豆花叶病毒强毒3号株系，于开花前后进行抗性调查，大豆抗花叶病毒病鉴定植株病情级别划分标准见表3，大豆抗花叶病毒病抗性评价标准见表4，抗性调查的结果见表5。 T1代。

33、B2H5040和大豆品种JACK接种大豆花叶病毒强毒3号株系后的苗期照片见图2A,花期照片见图2B。 T2代 B2H5040、 T2代B2H5048和大豆品种JACK接种大豆花叶病毒强毒3号株系后的花期照片见图 3。 0081 表3 大豆抗花叶病毒病鉴定植株病情级别划分 0082 0083 0084 0085 表4 大豆抗花叶病毒病抗性评价标准 0086 病情指数抗性评价 0免疫(IM) 0.120.0高抗(HR) 20.135.0中抗(MR) 35.150.0中感(MS) 50.170.0感(S) 70.1100.0高感(HS) 0087 表5 抗性调查的结果说明书 7/8 页 9 CN。

34、 104262472 B 9 0088 0089 结果表明：转基因大豆株系B2H5040和B2H5048对大豆花叶病毒表现出较强的抗性 (IM或HR)，其中株系B2H5040的两个世代在抗性调查中均表现为免疫(病情指数为0)，表明其抗性性状能够稳定遗传。 0090 结果表明： RSMV7基因的过量表达可以显著提高大豆抗花叶病毒病的水平。说明书 8/8 页 10 CN 104262472 B 10 0001 序列表 1/7 页 11 CN 104262472 B 11 0002 序列表 2/7 页 12 CN 104262472 B 12 0003 序列表 3/7 页 13 CN 104262472 B 13 0004 序列表 4/7 页 14 CN 104262472 B 14 0005 序列表 5/7 页 15 CN 104262472 B 15 0006 序列表 6/7 页 16 CN 104262472 B 16 0007 序列表 7/7 页 17 CN 104262472 B 17 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 18 CN 104262472 B 18 。