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《园艺的实验手册》doc版.doc

花匠小妙招
2024-11-11 23:04

文档简介

实验手册华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室细胞工程分室柑桔课题组二OO二年七月武汉目录前言1组织培养21、培养基母液的配制32、柑桔胚性愈伤组织的诱导53、柑桔原生质体操作64、柑桔胚性愈伤组织和茎尖的超低温保存115、微嫁接136、花粉的制备和保存13分子生物学141、DNA提取和检测152、Southern blotting193、Northern blotting274、AFLP 标记305、SSR操作步骤366、ISSR操作步骤377、根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化388、PCR 产物的TA克隆419、植物RNA的分离和纯化（异硫氰酸胍法）4710、GISH分析49仪器使用511、色彩色差计CR-300的使用流程及注意事项522、细胞流式仪（PA）操作规程555757前言We come here for the common interest. Every year we put our heart into the research so as to find something. But for a beginner it is of great difficulty for him to initiate the first step. Much time should be spent on the protocol reading, document retrieval and method optimization. In order to, to some degree if not completely, avoid this tedious, time-consuming and baffling period the students in the Citrus Research Group of Cell Engineering Division of National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, come up with the idea of summarizing their research protocols and ideas, which is what you will see now. I think this will be of great help for those who want to do the similar work shown herein. Though you can see the protocols in other references you cannot get every detail for the experiment because the introduction there is very sketchy. On the contrary you can see the details from the students personal generalization in this manual. The present manual covers many horizons of biological sciences, ranging from tissue culture to molecular markers that are state-of-the-art topics for the time being. In addition some introduction of machine operations are included so that those who want to use the instrument can benefit from this manual. Thanks should be extended to Prof. Xiuxin Deng for his kind offer of the financial support for the smooth publication of this manual. In the meantime gratitude should be given to all of the postgraduate students who have been working, are working here. Without their hard work we would not have been able to get a very through summary of the work.第一部分组织培养1、培养基母液的配制一.大量元素(10倍液)：称取下列药品分别溶解定容到1升后，加到5升存储瓶中。KNO3 95gNH4NO3 82.5gKH2PO4 8.5g MgSO47H2O 18.5gCaCl22H2O 22.0g注意事项：1配置母液前要仔细清洗存储容器2.应按照顺序分别彻底溶解后混合，每加完一种药品，摇动存储瓶使其混合均匀；3.溶解时最好加热，以便充分溶解，避免沉淀的产生；4.夏季要用新制的蒸馏水，并加热，这样可以避免因为水中带菌量过大而产生沉淀，同时可以减缓绿藻的生成；5.沉淀的产生一是由于溶解不充分就混合造成的（浑浊型沉淀），所以配置时一定不要急；二是由于长菌而产生絮状沉淀，所以要用新制的蒸馏水并加热。二.微量元素母液的配制(100倍)：取少量(200-300ml)温水依次加入下列药品，每加一种药品后搅拌溶解，最后定容到1L：KI 0.083gH3BO3 0.62g ZnSO4*7H2O 0.86gNaMoO4*2H2O 0.025gCuSO4*5H2O 0.0025gCoCl2*6H2O 0.0025gMnSO4*4H2O 2.23g (MnSO4*H2O 1.69g)注意：配好后在室温下放置10 h以上再放入冰箱保存，即刻放入冰箱易产生结晶沉淀。配制过程中产生沉淀的原因有：1. 前一个没彻底溶解就加入了后一个药品；2. 蒸馏水pH 值过高，可加几滴盐酸校正。三.甘氨酸和肌醇的配制(100倍):甘氨酸: 0.2g溶解定容到一升; 肌醇: 10g溶解定容到一升。四.铁盐的配制（100倍）:称取EDTA 3.73 g , FeSO47H2O 2.78 g , 分别溶解后混合定容到1L,放入棕色细口瓶中,室温放置10 h以上（防止结晶沉淀），然后放入4冰箱。五.维生素B的配制（100倍）：改良MT ： VB1（盐酸硫氨素）1g, MS： 10mgVB6 (盐酸吡哆素) 1g , 50mgVB5 (烟酸) 0.5g, 50mg分别称取顺序溶解在温热的蒸馏水中，定容到1升。注: 需要溶解完一个再加另一个。VB5不易溶解,需要搅拌,必要时可以加热。六.Vc的配制：称取Vc 0.5g 溶解在蒸馏水中，定容到1升即可。七.其它BA, NAA, IBA, GA3等激素类试剂可先用少量1N NaOH 彻底溶解, 再加水定容。配好后在室温放置一段时间，再放入冰箱中冷藏保存。有些试剂在乙醇或盐酸中也可溶解，但比较而言，用碱溶解比较稳定，不易产生沉淀。注意：母液最好不要配制太多，如果配制的量较大，短时间内用不完，最好分装一部分到小的细口瓶中，在做培养基时使用。这样不容易产生沉淀。2、柑桔胚性愈伤组织的诱导1 幼嫩胚珠诱导愈伤组织培养基（1）MT+ME（500mg/L)（2）MT+BA10mg/L（3）MT+IAA(0.1mg/L)+KT(0.5mg/L)2成熟果实未发育胚珠诱导愈伤组织培养基（1）GA3（1mg/L）+SAD(40mg/L)+MT(2) 2,4-D（0.01mg/L）+BA(0.1mg/L)+MT附成熟果实未发育胚珠的灭菌及培养方法：取成熟果实，将果实剖开，去掉果肉，可发现囊衣内紧靠中柱处有许多未发育的小胚珠，长约1.5-2.5mm。用小镊子将这些未发育胚珠轻轻挑下，放入一培养皿中，培养皿中预先放入一张滤纸，以预防小胚珠干燥失水，取无菌滤纸一张，漏斗一支，将滤纸放入漏斗中，而后将已取出的小胚珠放入其中，再将3%次氯酸钠倒入漏斗进行消毒，消毒15分钟后，用无菌水进行冲洗3-5次，每次10分钟，然后将滤纸及小胚珠取出接种于诱导培养基中，进行暗培养。1-2个月后即可看到有胚状体的形成，有的从胚状体上直接形成愈伤组织，有的胚状体继续发育形成小植株，部分胚状体会产生次生胚状体，将这些胚状体在MT+AgNO35mg/L培养基上进行暗培养，有利于愈伤的形成。3、柑桔原生质体操作一、材料的准备1. 胚性悬浮系的建立：从固体培养基上取继代20天左右生长旺盛的愈伤组织于MT +ME 0.5g /L+ 谷氨酰胺1.5 g/L +蔗糖 40g/L 的液体培养基中（每瓶50 ml），100转振荡培养，每两周继代一次，3 代后用于分离原生质体。2.无菌苗的获得：柑桔种子无菌条件下播种于MT培养基上，20-30天后叶片充分展开后用于分离原生质体。二、原年质体的分离1. 悬浮系原生质体的分离：用吸管吸取1g 左右的继代6-10 天的悬浮培养物于15x60 mm的培养皿中，吸干培养基，加入1.5 ml 0.7 EME 和1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28暗条件下酶解16-24小时。2. 叶肉原生质体的分离：1.5 ml 0.6 EME 加入一15x60 mm的培养皿中，在此培养皿用解剖刀将叶片切成0.05-0.1cm的细条，后加入1.5 ml 酶混合液，轻轻摇匀，封口膜封口，置于摇床上（20-30转）或静置，28暗条件下酶解16-24小时。三、原生质体的纯化：1. 酶解后的原年质体经孔径为45 m 的不锈刚网去掉渣质,CPW13 洗涤以收集大量原生质体,滤液在10ml 离心管中离心（100转）10分钟，使原生质体沉于管底。2. 沉淀物用3ml CPW25 悬浮，在其上轻轻加入1ml CPW13 ，100转离心2-6 分钟，原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。（注：如果此种情况下无法形成界面，则原生质体沉淀物用CPW13 悬浮）3. 将原生质体轻轻吸出，置于另一离心管中，用电融合液离心洗涤6-8分钟，去掉上清液，用电融合液悬浮至5-10 x 105 个/ml 备用。（用血球计数板调密度，一个大方格中原生质体数x10000即是原生质体密度）四、原生质体活性检查FDA用丙酮配制成5 mg/ml 的浓度。按25 l FDA /ml 原生质体的比例加入FDA，5 分钟后在万能显微镜下检查原生质体活性（暗视野下发荧光原生质体数/明视野下原生质体总数）。注：叶肉原生质体发红色荧光，而悬浮原生质体发黄色荧光。五、原生质体融合一） PEG法1. 将悬浮好的双亲原生质体等体积混合2. 用吸管滴2 滴混合好的原生质体于15 x 60cm 塑料培养皿中央，立即加入40% 的PEG 2 滴诱导融合3. 10 分钟后，加入稀释液（9A/1B）2 滴4. 15 分钟后，从边缘缓缓加入 12 滴EME 培养基，保持20分钟后用吸管沿边缘小心移走5. 从边缘再加入15滴EME 培养基，保持10分钟后小心移走。6. 重复步骤5 两次7. 最后加10-15滴BH3 培养基，在培养皿中央形成一小池，沿培养皿边缘加入15-20滴BH3 培养基，保持培养皿内的湿度，封口膜封口。二）电融合法1. 将双亲原生质体用电融合液悬浮，混合备用（胚性愈伤组织原生质体1-5 x 105 个/ml；叶肉原生质体10-20 x 105 个/ml）.2. 融合小室先用融合液洗涤，以防原生质体聚集于电极两侧的角落里，然后取大约 0.8 ml （FTC-03）或 1.6 ml （FTC-04）悬浮液于环形融合小槽，融合小室中央加几滴电融合液以保持湿度，parafilm 封口。3. 静置5-10分钟，待大量原生质体沉淀后，在选择好的电融合参数下诱导融合，倒置显微镜下观察融合过程。4. 融合后，静置15-20分钟以利于融合的原生质体圆球化。5. 轻轻吸出融合产物于10 ml 离心管中离心5-6 分钟，用培养基悬浮至0.5-1 x 105 个/ml .六、原生质体培养1. 原生质体培养常采用液体浅层培养或固体包埋培养法。2. 原生质体培养在暗培养箱中进行，3-10天后原生质体再生细胞壁，并开始第一产次分裂。3. 等原生质体分裂形成多细胞团时（大约20-30天），开始降低培养基的渗透压，具体：1）各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.45 M2) 7 15 天后再各加入5-10滴0.6 M BH3和0.3M EME培养基，降压至0.3 M3）此后要及时稀释，降低细胞团的浓度，以利于胚状体发生，等细胞团长到一定大小时，转入EME500上诱导胚状体的发生。4）细胞团长出球形胚、心形胚后，及时转入EME 1500培养基上，以利于胚状体的进一步发育和转绿。5）将发育到子叶胚时期的胚状体转入生芽培养基（MT+BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA 0.1mg/L）中诱导丛生芽。6）将丛生芽转入生根培养基(1/2MT+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L)中诱导生根或嫁接到试管中的砧木上。7）再生苗的鉴定及移植于温棚中。七、再生苗的鉴定方法1 形态学观察：叶形、气孔等。2 细胞学观察：海氏苏木精法3 分子标记鉴定：RAPD，AFLP，SSR，CAPS，RFLP等八、相关培养基的配方1. 酶液混合液（仅供参考，不同时间购买的酶活力不同，故浓度会有不同程度的变化） 40ml 60ml 甘露醇（12.7%） 5.10g 7.68g NaH2PO4.2H2O (0.011%) 0.0044g 0.0066gCaCl2.2H2O (0.36%) 0.144g 0.216gMES (0.12%) 0.048g 0.072gCellulase R-10 (1.5%) 0.6g 0.9%离析酶 R-10 （3%） 1.2g 1.8g2. EME 培养基：MT+500mg ME（麦芽提取物）0.3 EME: MT+500mg ME/L+ 102.5 g 蔗糖/L0.6 EME: MT+500mg ME/L+ 205.38 g蔗糖/L0.7 EME: MT+500mg ME/L+ 239.61 g蔗糖/LEME 500: MT+500mg ME/L+50g蔗糖/L+7g 琼脂/LEME 1500: MT+1500mg ME/L+50g蔗糖/L+7g 琼脂/L3. 电融合液（100ml）甘露醇 (0.7M): 12.74g 无水CaCl2 (0.25mM): 0.02775g PH值：5.8 ,高压灭菌4. CPW stock I (100ml) CPW stock II (100ml) KH2PO4 0.272g 无水CaCl2 1.5g KNO3 1.0g MgSO47H2O 2.5g KI 0.002g CuSO45H2O 0.00003g CPW13 (100ml)： CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml +13g 甘露醇 CPW26 (100ml): CPW stock I 1ml + CPW stock II 1ml + 26g 蔗糖5 PEG 融合液（100ml） PEG (分子量 6000) 40g H2O 80ml 无水CaCl2 0.97g Glucose 5.41g 定溶至 100ml，加热溶解，PH 6.0，过滤灭菌6稀释液A ： Glucose 7.21g 稀释液 B: Glycine 2.25g ( 100ml) 无水CaCl2 0.97g PH 10.0 过滤灭菌（KOH） DMSO 10mlPH 6.0 过滤灭菌使用前按9A:1B混合澄清。7 BH3培养基( 1升)ME蔗糖甘露醇谷氨酰胺MgSO47H2OKH2PO4KClMT 微量元素MT Ca +MT vit +MT 铁盐各水解酪蛋白Vit Stock AVit Stock BKI Stock有机糖贮存液有机酸贮存液椰子汁1.0g51.34g81.99g3.1g0.37g0.17g1.5g10ml10ml0.25g2.0ml1.0ml1.0ml10ml10m20ml定容到1000 ml， pH5.8 过滤灭菌KI stock75 mg/ 100ml有机酸贮存液(mg/100ml)丙酮酸钠盐200柠檬酸400苹果酸400延胡索酸400有机糖贮存液果糖核糖木糖甘露醇鼠李糖纤维二糖半乳糖甘露醇(mg/100ml)25002500250025002500250025002500Vit stock AMg/100ml生物素1核黄素10叶酸20对氨基苹果酸1氯化胆碱50VC100Caloium pantathenase50Vit Stock BMg/100mlVit A1Vit D31Vit B1224、柑桔胚性愈伤组织和茎尖的超低温保存胚性愈伤组织超低温保存1. 建立悬浮系取大约3克胚性愈伤组织，在含500mg/L麦芽提取物和5g/L的谷胺酰胺的MT培养基中，在摇床上进行悬浮培养。2. 玻璃化冻存取悬浮培养8-10天的细胞系0.3mg左右，加入1.8ml冷冻管，吸干培养基，然后加入15mlPVS2玻璃化溶液，迅速颠倒然后，100g离心5min,弃上清液，用0.5mlPVS2重新悬浮愈伤组织后处理3min，将冻存管迅速投入液氮，进行保存3. 解冻，超低温保存一段时间后，将冻存管从液氮中取出，迅速投入40 度水浴中化冻，无菌状态下，弃去PVS2，加入1.5ml1.2M蔗糖溶液，颠倒混匀后，处理约10min，中间混匀两次，弃去上清液4. 培养将愈伤组织转入直径90mm的培养皿中（内含20mlMT固体基本培养基）的两层滤纸上，过夜后，愈伤组织连同上层滤纸一起转入新的培养基上，在常规条件下或弱光下培养。茎尖的超低温保存1预培养取在BA1.5/L+IBA0.2mg/L+MT培养基上继代的试管苗，切取1mm长的茎尖，在DMSO5%的MT培养基上进行预培养3天，2装载与脱水无菌状态下切取2mm左右的顶端，放入60%PVS2中装载（loading）30分钟,后在0度下用PVS2处理60分钟，将材料与PVS2一起转入冷冻管，放入自制纱布袋中，迅速投入液氮。3 化冻与洗涤将装有冷冻管的纱布袋从液氮中迅速取出，在40度水浴中化冻，然后在无菌状态下吸出PVS2，加入1.2M蔗糖+MT培养基，洗涤3-4次，每次10分钟。4恢复培养将材料转入原生芽培养基中暗培养，一天后换新鲜培养基，暗培养一周后，转入光培养。注：PVS2成份：甘油30%+乙二醇15%+DMSO15%+0.4M/L蔗糖+MT基本培养基。各成份先灭菌后，再配制。5、微嫁接1. 将枳等砧木种子无菌条件下接种在MT培养基上，暗培养箱中暗培养15-20天左右（高度大约为4cm 左右），选取粗壮的黄化苗用于嫁接。2. 将接穗芽留0.5-1.0 cm 长，用手术刀片将其基部削成契形，与此同时，将试管中黄化砧木在子叶下去掉主根，在子叶上1.0-1.5 cm 处去掉茎，并将其劈开。随后，将接穗芽插入裂口。3. 整个操作过程均在无菌条件下进行，并且动作要快。4. 伤口愈合后，及时清除砧木的萌捏孽。5. 待伤口充分愈合后，并且接穗芽长出新叶后，移入温室。6、花粉的制备和保存1. 花的采集：选取大气球期花蕾或刚刚开放的花，这样的材料出粉量大，花粉质量好。2. 散粉：材料采回后，取下花药，在27左右的室内或烘箱内放置散粉。3. 保存：散粉完成后，在30左右的烘箱中放置6h 左右，使花粉充分干燥，然后装入青霉素小瓶或盛放胶卷的塑料瓶中，用PARAFILM 封严密，然后放入-20冰箱中可长期保存。第二部分分子生物学1、DNA提取和检测实验准备工作：1 所用离心管、枪头要洗净、烘干（最好灭菌）。2 试剂配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取Tris-Base 121g, 加入约800 ml 水在磁力搅拌器上搅拌，使其充分溶解后加入浓盐酸调整pH至8.0后加水定溶至1000 ml. 灭菌后于室温保存。0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取EDTA-Na2盐 187 g 加入约 800 ml水，在磁力搅拌器上边搅拌边加入固体NaOH，当EDTA和NaOH均完全溶解，溶液变清时其pH值刚好达到8.0左右，再用pH试纸略加调整即可, 灭菌后于室温保存。5.0 M NaCl: 称取NaCl 300 g, 加入蒸馏水约800 ml 于磁力搅拌器上充分搅拌，约5分钟后停止搅拌，静止23分钟，倒出上清液，再加入100 ml蒸馏水重复前面的步骤，直到NaCl充分溶解后定溶至1000 ml., 灭菌后于室温保存。酚：氯仿：异戍醇（25：24：1）的配制：可参考分子克隆亦可按如下方法配制取重蒸酚100 ml ，蒸馏水50 ml，8-羟基喹咛0.05g 加入500 ml玻璃烧杯于磁力搅拌器上边加热边搅拌，待酚达到水饱和后加入18 g Tris-Base，等Tris-Base 完全溶解后加入100 ml氯仿：异戌醇（24：1），搅拌1020分钟，静止约10分钟，除去上层水相后，装入棕色瓶，最后加入20 ml 0.1M的Tris-HCl保护液于4保存。DNA Buffer的配制：1 M Tris-HCl (pH 8.0) 100 ml0.5 M EDTA (pH 8.0):100 ml5.0 M NaCl:300 mlH2O500 ml灭菌后于室温下保存3个月左右，用时按1.5%往Buffer中加入CTAB，在电炉上烧开；在通风橱里加入1%的巯基乙醇( 现配现用)。DNA的提取：1 取25 g叶片或愈伤组织，加入适量液氮研碎，转入预冷的50ml离心管，加入20 ml DNA提取缓冲液充分摇匀，于65水浴6090 min，中途轻轻摇匀两次。2 加入15 ml 氯仿：异戍醇（24：1）轻轻摇匀10分钟，于BECKMAN离心机中4000 rpm离心15分钟。3 取上清液于另一50 ml离心管加入10 ml 氯仿：异戍醇（24：1）重复步骤2。4 吸上清液于一干净的50 ml 离心管，加入15 ml 冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入5 ml 76%的乙醇（含10 mM NH4Ac）浸泡5 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。5 弃乙醇风干沉淀约半小时，加入3.0 ml TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0；1 mM EDTA , pH 8.0），20 l RNase A（10 mg/ml），37温浴过夜。6 溶液转入一10 ml离心管，加入3.0 ml苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）充分颠倒混匀，4000 rpm离心15 min，吸上清液于另一10 ml的离心管中，（可重复一次）。7 加入1 ml 5.0 M的NaCl和3.0 ml水饱和乙醚，充分混匀，4000 rpm离心5 min。8 弃乙醚，用20 l枪头挡住离心管管口内侧，用力下压枪头，使枪头与管壁间形成一狭缝，让下清液从缝中流入另一10 ml离心管。9 加入5 ml冷冻的异丙醇，轻轻摇匀后于-20冷冻半小时，4000 rpm离心10分钟。弃上清液，加入3 ml 70%的乙醇浸泡46 h（或过夜），中途换乙醇2-3次。风干乙醇，加入500 l TE溶解，或浸在乙醇中长期保存。DNA检测1 取DNA原液15 l稀释至3.0 ml，用UV-1601型紫外分光光度计测定230 nm、 260 nm及280 nm的吸光值。高质量的DNA要求：A260/A2302.0； 1.7A260/A2801.92 将DNA原液适当稀释后，用1 TAE，0.8%琼脂糖凝胶2V/cm电泳1 h进行质量检测。3 向一定量的DNA中加入限制性内切酶EcoR I至4-5U/g DNA，37消化过夜，用0.5 TBE，0.8%琼脂糖凝胶2.5V/cm电泳3 h进行检测。CTAB法微量提取DNA1. 药品的配制: CTAB提取液：(1)100mM Tris-HCl(PH 8.0),1.5M NaCl,50mM EDTA(PH 8.0)(2)1% PVP,2% CTAB(3)取少许(1)加到(2)中，搅拌成糊状,后加(1)至足量,65水浴充分溶解备用。使用前要在65温浴一会儿，然后加入1-4%巯基乙醇,混均匀。苯酚：氯仿：异戊醇（25241）：重蒸酚65水浴溶解，在烧杯中加入80ml温热的蒸馏水，加入少许8-羟基喹啉，溶解后加入100ml重蒸酚，再加入100ml氯仿：异戊醇（24：1），加入20克Tris Base，磁力搅拌器上搅拌1.5 h左右至停止搅拌后很快分层，然后装入棕色瓶中，4冰箱中储存备用。2. 材料的采取与保存：在超净工作台上，取试管苗叶片，放入无菌的1.5 ml离心管中，置于冰盒中，然后把装有叶片的离心管一起装在纱布袋中，置液氮中冷冻10分钟，取出后置于70冰箱中可长期保存，需要用时，取出置于冰盒中。3DNA的粗提在装有叶片的离心管中加入石英砂少许（约0.07克），用事先灭过菌的20冰箱中预冷的尖头玻棒将材料戳到底部，先压后研磨，研细后加入600 ul CTAB提取液，再继续研磨一会儿使其悬浮均匀，然后在65水浴锅中温浴60-90分钟，隔30分钟取出上下轻轻颠倒几次，水浴之后，加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下晃动10分钟以上，其间置于37水浴锅中温浴一会（冬季），使之充分混匀，然后10000-12000rpm离心5-10分钟，吸取上清液转至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入-20冰冻无水乙醇1ml，轻轻颠倒数次，混合均匀后冰冻30分钟沉淀DNA，然后8000-10000rpm离心5分钟，弃上清液，加入1 ml 70%酒精浸泡2小时或过夜，8000rpm离心5分钟,弃酒精之后在工作台上风干DNA，注意不要过干，否则会使以后溶解困难。4. DNA的纯化：向风干后的DNA中加入500 ul 1xTE，37水浴15-30分钟至DNA完全溶解，然后加入700ul苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），上下颠倒离心管约10分钟，至充分混匀，其间置于37水浴锅中温浴一会（冬季）；10000-12000 rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入700ul氯仿：异戊醇（24：1），颠倒10分钟（方法同上），10000 -12000rpm离心5分钟，吸取上层液至另一离心管中，加入60 ul 5M NaCl，再加入1ml冷冻的无水乙醇，轻轻颠倒，然后在-20冰箱中置30分钟沉淀DNA，8000-10000 rpm离心2-3分钟，使DNA分散状紧贴在管壁上，弃酒精，加70%酒精1ml浸泡,2小时后换一次,后浸泡过夜，8000rpm离心3分钟后弃酒精，风干，加50-100ul1xTE充分溶解，然后每管加5ul 5mg/ml Rnase,37水浴6小时或过夜。5. DNA检测:（1）0.8%琼脂糖凝胶电泳30-60分钟：TAE 100ml，EB 30ul，样品3-5ul，电压90V，观察A：DNA是否跑出，带型是否整齐划一；B：RNA是否除尽（2）分光光度计检测D260/D280的比值：在1.8-2.0的范围内认为纯度较高上述方法提取的DNA比值在1.65-1.95之间。浓度=30000xOD260（DNA样品为5ul时）。2、Southern blotting实验前准备工作：5 X TBE溶液配制：约800 ml蒸馏水中加入Tris-base 54 g，硼酸27.5 g，充分溶解后加入0.5 M EDTA（pH: 8.0）定溶到1000 ml, 于室温下短期存放。1 将DNA稀释至500 ng/l.，并电泳检测。欲转到同一张膜上的DNA浓度是否一致，若亮度差异太大，则应进行进一步的浓度校正。2 在200 l 微量离心管中加入25 l DNA样品，6.5 l 限制性内切酶（MBI，10 U/ l）和8 l 相应的buffer，上加一滴矿物油覆盖, 在旋涡器上混匀并稍微离心后放于37水浴16-18小时。3 取5l 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。4 于DYY-III34A型电泳槽中制备3/4 块0.8%的1X TBE琼脂糖凝胶需要胶260300 ml。5 向每个样品中加入5 l 溴酚蓝上样缓冲液, 混匀后稍微离心后点样。（样品多时点样要迅速，以防先点的样品DNA在胶中扩散；点样时我不主张加混有二甲苯菁的上样缓冲液，因为它影响染色后的照相效果；点样时要注意Marker最好采用不对称点样，以便在X-光片上确定样品顺序，同时Marker的点样孔使用其配套的上样缓冲液，其中有二甲苯菁以便确定凝胶的正反面。）6 点样后在1 X TBE电泳缓冲液中250 V 高压电泳10分钟后把电压调至40 V 电泳1214 小时，这时溴酚蓝已离开点样孔10 cm左右。7 将胶置于装有EB的瓷盘中染色1520分钟，在紫外灯下用塑料板切除多余的凝胶，凝胶点样孔一端及两侧应留出2 mm左右，溴酚蓝一端要保留溴酚蓝作为变性处理的显色指示。（这一步非常重要，如果样品酶切不充分、电泳泳道不直、样品间相互弥散或样品间DNA量差异太大都不能再往下做，要找出原因后重新再做。最好把待Blot的凝胶规格控制在其宽度或长度之一为10 cm，因为我们使用的尼龙膜的规格为 30 cm X 3 m 这样不至于浪费昂贵的尼龙膜，同时酶切的DNA smear 长度达到10 cm时各片段也能得到很好的分离。）Southern Blotting onto Hybond-N+ Nylon Membrane Hybond-N+ Nylon Membrane, 0.45 l pore size, 20 cm x 3 m rolls available from Amersham (Cat. # RPN. 203B)实验前准备工作：酸变性液和碱变性液的配制：Depurination solution:11 ml HCl989 ml distilled waterMix. store at room temperature for up to 1 month.Denaturation buffer87.66 g NaCl20 g NaOHAdd approximately 800 ml of distilled water. Mix to dissolve. Make up to a final volume of 1000 ml. Store at room temperature for up to 3 month.1 将切好的胶夹在两块软塑料板之间，小心翻转180度, 使胶底面向上。2 将胶放入20 X 30 cm的瓷盘中加入500 ml 脱嘌呤溶液（酸变性液），偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色，大约需要1530分钟。3 用软塑料板小心将胶转入另一洗净的瓷盘，用水漂洗凝胶23次，将水倒尽，加入碱变性液500 ml 偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色（大约需要2030分钟）。4 洗净一块15 X 25 cm 的玻璃板和4块旧的X光片条；切两块20 X 30 cm的滤纸。5 取一洗净的20 x 30 cm瓷盘，把干净玻板横放于盘上，把切好的滤纸在碱变性液中浸湿，平整地铺在玻板上，使纸的两端自然下垂到盘中，用玻棒赶尽玻板与纸之间的气包后再按同样的方法铺上第二层滤纸，往盘中加入500 ml 碱变性液。6 经碱变性处理好的胶用软塑料板小心转移到滤纸桥上，用X 光片条把胶的四周约0.5 cm宽与滤纸隔开，使转膜液必须经过胶进入吸水纸，使胶上的DNA能充分印迹到尼龙膜上。7 用尺子量好胶的尺寸后，用锋利的剪刀剪取同样大小的尼龙膜，用铅笔在膜的一角做好标记如点样顺序、使用的内切酶，膜的编号、转膜日期等，将膜用蒸馏水浸湿后放于胶上，使膜与胶完全重合，用玻棒赶尽膜与胶之间的气泡（膜一旦放到胶上就不能再移动）。8 切两块与膜同样大小的滤纸，用水浸湿后覆于膜上，赶尽气包；在上面放10 cm 厚的吸水纸，上面放一小玻板，板上加一500 g左右的重物。9 46小时后换一次吸水纸，之后隔810小时再换一次吸水纸，印迹1824小时胶上的DNA一般都能充分转移至尼龙膜上。10 取出尼龙膜，用滤纸包好放入80烘箱烘烤2小时后用保鲜膜包好放于4保存。Southern 杂交实验准备工作：试剂配制：50 x Denhardts solution1.0 g Bovine serum albumin（BSA，牛血清蛋白）1.0 g FicollMT 400（聚蔗糖）1.0 g Polyvinylpyrrolidone （PVP）Add approximately 50ml of distilled water. Mix to dissolve. Make up to a final volume of 100ml. Store at -20 for up to 3 months.25 x SSC 219 g NaCl 110 g Tri-sodium citrate（柠檬酸三钠）Add approximately 800 ml of distilled water. Mix to dissolve. Check the pH is 78. Make up to a final volume of 1000 ml. Store at room temperature for up to 3 months.P/H Stock solution165 ml 1M Tris-8.066 ml 0.5M EDTA-8.0660 ml 25 x SSCAdd distilled water to make up to a final volume of 1000ml. Store at RT for up to 3 months. TE buffer1.21 g Trizma base0.372 g EDTA, sodium saltAdd approximately 800 ml of distilled water. Mix to dissolve. Adjust to pH 8.0 with concentrated hydrochloric acid. Make up to a final volume of 1000 ml. Store at room temperature for up to 3 months.第一天早上做好以下步骤：1 将所有欲杂交的尼龙膜用2 X SSC浸泡1030分钟。2 打开同位素室的空调，把杂交管放入杂交炉，并将杂交炉调至65预热，用塑料桌布铺好防护罩内的台面，桌布上再铺一层滤纸，从冰箱中取出装同位素的铅罐，拧松罐盖，使同位素在室温下解冻。3 打开一楼的电炉，用500 ml玻璃杯烧2/3杯开水。4 将配好的10 mg/ml鲱鱼精DNA在开水中变性10分钟后立即放入冰中冷确至少10分钟。5 按15 ml/200 cm2配制预杂交液，并预热至65，带入同位素室。STOCK105075100125150175200250dd H2O6.83451688510211913617050 x Denhardts0.21.01.52.02.53.03.54.05.010 % SDS 0.21.01.52.02.53.03.54.05.0P/H Stock2.7013.520.252733.7540.547.255467.510%鲱鱼精DNA (ml)0.21.01.52.02.53.03.54.05.06 按计划把尼龙膜放入各杂交管，加入预杂交液于65预杂交6小时。放膜时要注意：几张膜叠放在一起时要把膜浸有在2 X SSC或蒸馏水中，赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管，并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡，最后加入预杂交液，盖好管盖。7 按下表配制探针标记体系。探针标记体系（按顺序进行）：ddH2O (l)20Probe (50 ng/l) (l)3.0/Hind (1ng/l) (l)1.52.0 ng/ul Primer (l)20.02.0 mM dNTP (A,T,G) (l)8.010 X Klenow Buffer (l)6.08 100煮10分钟，放入冰中冷确10分钟Klenow大片段酶（SABC）5U32P-dCTP (Ci)30以上体系可杂交约400 cm2的杂交膜，根据杂交膜的面积，按比例增减体系即可。9 从37水浴锅中取1.5升37温水，倒入同位素室的保温筒。把放探针的小冰盒带入同位素室，加入同位素并用枪头反复吸几次使探针标记体系充分混匀，插入一块小泡沫块后放入保温筒，使装探针的小离心管漂在水面上，37保温6小时。10 预杂交半小时左右，要检查杂交管盖是否盖好。第一天下午3:30左右：11 配制杂交液按1020 ml/管配制，将杂交液预热至65。杂交液的配制:(按顺序加入,10 ml/ 200 cm2 膜 )总体积（ml）10152025303540455060100硫酸葡聚糖（g）1.01.52.02.53.03.54.04.55.06.010.0ddH2O (ml)6.810.213.617.020.423.827.230.634.040.868.050 X Den (ml)0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.22.010%SDS (ml)0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.22.0P/H Stock (ml)2.74.55.46.88.19.511.012.213.516.227.010%鲱鱼精DNA (ml)0.50.751.01.251.51.752.02.252.53.05.0配制：（1）+（2）+ （3）+（4）+（5）加热至65充分溶解混匀后加入杂交管10%鲱鱼精DNA于