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我国中药材禁用农药残留现状、毒性及分析方法研究进展

花匠小妙招
2024-11-12 16:16

我国中药材禁用农药残留现状、

毒性及分析方法研究进展

孙新琪，安芳，鹿倩，李春雨，骆骄阳，杨美华

中医药作为中华民族的瑰宝，距今已有 5 000 多年的历史。近年来，在中药材种植过程中，为减少病虫草害等造成的损失，农药被广泛使用。目前，中药材中农药残留问题已引起国内外普遍关注。2019 年，我国出口的中药材被退回或扣留 60 批次，其中因农药残留问题被退回的占 47%，比例最高。2020 年 1—6 月，我国出口的中药材因农药残留等原因被退回 31 批次，同比增加 48%[1]。农药残留已成为影响中药质量和安全、制约我国中药材国际贸易的重要因素。

与《中国药典》2015 年版[2]相比，《中国药典》2020 年版[3]在 0212 通则中收录了药材及饮片（植物类）33 种禁用农药，规定不得检出（不得超过定量限）。大多数禁用农药毒性作用强、持久性强、难降解、对人体危害大，已成为中药农药残留中的重点管控对象，见表 1。因此，厘清中药中禁用农药残留现状、毒性及残留分析方法，对中药中农药残留标准制修订，保障中药材安全，突破国际贸易壁垒具有重要意义。

2 中药中禁用农残现状

因土壤残留或使用、管理不当等问题，部分禁用农药在中药中仍有检出。农药的广泛使用，一方面会导致土壤酸化、板结[5]。另一方面，残留在土壤中的农药经由雨水、地表径流或灌溉水等渗入到地表或地下水中，会造成水源的污染[6]，对水生生物产生危害，影响水体食物链[7]，危及生态环境、生态系统和人类健康。据报道，我国每年由于农药污染食品引起中毒的人数近 20 万人，约占食物中毒总人数的 1/3[8]。在致癌因素中，农药因素约占 60%。通过食物链进入体内的农药约占 90%，通过大气和饮用水进入体内的农药约占 10%[9]。

《中国药典》2020 年版收录的 33 种禁用农残，主要为有机磷农药（19 种），其次为有机氯农药（6 种）。有机磷农药主要通过人工喷洒的方式进入中药，因此极易在花类、叶类和全草类中药中检出。顾炎等[10]在金银花中检出了水胺硫磷等高毒有机磷农药。李家春等[11]对三七、川贝母、薏苡仁、桂枝、金银花 5 种常用中药中 35 种有机磷农药残留量进行了快速筛查检测，结果显示 50 份样品中 3 份检出高毒禁用农药甲胺磷。但有机磷农药易自然降解的特性使其在土壤中残留量较少。与有机磷农药不同，有机氯农药理化性质稳定，难降解且半衰期长，易于在环境中积累，可通过食物链在生物体内富集，因此此类农药对生态环境、动植物及人体健康造成的影响不容忽视[12]。我国在 20 世纪 50 年代曾大量生产和使用有机氯农药，造成其在土壤中残留严重。尽管从 1983 年起我国已经禁止或限制生产这些有机氯农药，但是由于难降解的特点导致其在大气、土壤、水体等环境介质中仍广泛存在[13]。何清彦等[14]曾考察了 10 种（共 30 批）药食两用中药材中有机氯农药的残留情况，结果 30 批药材均被检出禁用农药六六六、滴滴涕，其中当归、党参等根及根茎类药材残留量相对较高，花类药材相对偏低，见表 3。

农药被禁用的原因主要为具有毒性和难降解，鉴于目前禁用农药的污染状况，充分了解其主要毒性，对于后期的风险评估有着至关重要的作用。因此，将对禁用农药的毒性进行详细的介绍。

3 禁用农药毒性

《中国药典》2020 年版中 33 种禁用农药按化学结构主要分为有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、脒类、磺酰脲类、苯基吡唑类及醚类[28]。鉴于目前的研究报道进展和结合实际污染频率，本研究重点归纳前 3 种禁用农药的毒性。3.1 有机磷类禁用农药有机磷农药（organophosphorus pesticide，OPs）是应用最广的杀虫剂，其结构通式见图 2 [29]。

X 代表硫原子或氧原子；Z 代表苯氧基、烷氧基或其他更为复杂的取代基团；R1、R2代表甲氧基（-OCH3）或乙氧基（-OCH2CH3）等，取代的基团不同从而衍生出各种不同的化合物[30]。OPs 的毒性取决于其结构中心 P 原子的电正性，4 个位点的取代基种类和构型对其毒性均有显著影响[31]。一般来说，组成、结构相似的有机磷农药，分子长度越长，分枝越多，环和杂原子类型及数目越复杂，其毒性就越强。《中国药典》2020 年版禁用的 33 种农药涉及有机磷农药 19 种，包括甲胺磷、甲基对硫磷、久效磷等（表 2）。

3.1.1 有机磷类禁用农药的毒性

OPs 是我国使用量最大且中毒发生率最高的一类有机农药。目前，相关报道证实禁用的 OPs 能够引起神经毒性、内分泌与生殖毒性、免疫系统毒性和肝脏毒性[29]。

3.1.1.1 神经毒性

OPs 的神经毒性主要通过抑制体内胆碱酯酶水解乙酰胆碱的能力，进而导致胆碱能神经突触中蓄积乙酰胆碱，引起毒蕈碱样、烟碱样和中枢神经系统症状[32]。此外，长期暴露于低剂量的 OPs，会降低人体血液中胆碱酯酶的活性[33]。据文献报道可知，上述禁用的 OPs 均具有神经毒性[34]。其中，甲胺磷作为最典型的代表，中毒后会引发迟发性神经毒性，诱导患者出现肢端感觉异常、无力、四肢运动障碍、肌肉萎缩等症状[35]。据郑容远[36]报道，甲胺磷中毒病人头痛、头晕等急性症状消失后，经过 10～30 d 潜伏期，少数病人仍可引起迟发神经病变。此外，ABON-DONIA M B[37]指出，甲胺磷引起的迟发神经病变还可破坏神经细胞膜内外离子梯度调节机制，导致神经纤维结节间水肿、变性，神经轴突退行性病变。

3.1.1.2 内分泌与生殖毒性

OPs 作为环境内分泌干扰物主要通过干扰激素的生物合成、代谢或生物作用对内分泌系统产生不利影响[38]。研究推测，OPs 主要通过介导下丘脑-垂体-性腺轴来影响性激素的合成与分泌，从而发挥内分泌干扰作用，引起生殖毒性[39]。OPs 对生殖系统和内分泌系统的毒性研究主要源于最初流行病学中发现 OPs 与不孕症之间的关联。根据文献调研[35]，禁用的 OPs 甲胺磷急性中毒的男性，往往表现为精子畸变增多、精子活动能力降低且数目减少、性功能减退等症状，表明甲胺磷具有较强的生殖毒性。有研究发现 0.3 mg·kg-1的水胺硫磷可导致大鼠睾丸组织发生病理改变，精子活动率降低和精子畸形率增加[40]。ZAHRAN M M 等[41]报道久效磷可以导致怀孕小鼠及其胚胎细胞的染色体畸变，血浆的蛋白含量、肝脏的 DNA、RNA 含量和胆碱酯酶含量下降，谷氨肽转移酶活性升高。

3.1.1.3 免疫系统毒性

OPs 可诱导癌基因和抑癌基因的表达，诱导巨噬细胞释放 α 肿瘤坏死因子，增加人类患癌几率[42- 43]。巨噬细胞广泛分布在体内，在先天性和适应性免疫中起着不可或缺的作用，能够参与各种免疫功能，例如吞噬作用、酶的释放、自由基的产生、抗原的呈递以及作为炎症过程的介质等[44]。于燕波等[45]研究证实低剂量对硫磷及重金属（铅、镉）联合可对大鼠白细胞介素、肿瘤坏死因子及免疫球蛋白产生影响，导致大鼠免疫失调。彭广军等[46]通过分析急性甲胺磷农药中毒者早期血液，证明血液中甲胺磷含量越高，细胞免疫受损越明显。

3.2 有机氯类禁用农药

有机氯农药（organo-chlorine pesticides，OCPs）主要分为以苯为原料和以环戊二烯为原料的两大类。《中国药典》2020 年版禁用的 33 种农药涉及的有机氯农药中以前者为原料的包括六六六、滴滴涕和三氯杀螨醇；以后者为原料的包括艾氏剂、狄氏剂和硫丹。3.2.1 有机氯类禁用农药的毒性研究证实，OCPs 容易随食物链富集，在人的肝、肾、心等组织中蓄积[47]，给人体健康带来较高的风险。目前，相关报道证实禁用的 OCPs 能够引起神经毒性、生殖毒性以及会致畸、致癌和致突变[48]。

3.2.1.1 神经毒性

OCPs 的主要作用部位为大脑运动中枢及小脑，可使其兴奋性增高，同时伴有大脑皮质及植物神经功能紊乱，引起神经退行性疾病。帕金森病作为最常见的神经退行性疾病之一，已影响全球 2%的 60 岁以上人口[49]。国内外很多研究证实，狄氏剂很可能是帕金森病的环境病因之一[50]。SHARMA H 等[51]通过检测狄氏剂对多巴胺能神经元的作用发现其可通过诱导氧化应激导致多巴胺能神经元功能障碍，从而引发帕金森病。SONG C J 等[52]发现，硫丹能诱导多巴胺能神经细胞产生自噬，从而导致神经退行性疾病的发生。此外，对一起硫丹急性中毒事件的调查统计[53]得知，部分病人暴露于硫丹环境中 2.5 h 后感受器官功能减弱，部分病人则出现了癫痫症状。这说明硫丹会对神经系统产生伤害，尤其是急性中毒后会产生很严重的影响。

3.2.1.2 生殖毒性

禁用的 OCPs 生殖毒性的作用器官主要为睾丸，通过干扰雄激素水平，诱发雄性动物生殖器官畸形。ANECK-HAHN N H 等[54]在检测非职业性接触滴滴涕年轻男子的精液时发现，暴露于高水平滴滴涕的男子精子数量减少、活动度降低且精子畸形率增多。SAIYED H 等[55]研究了常年处于硫丹气雾喷射地区的 117 名少年和青春期男性的生殖发育情况，发现暴露组血清中硫丹水平（包括 α-硫丹、β-硫丹和硫丹硫酸酯）要远远高于对照组，此外暴露组血清促黄体生成素水平显著升高，而血清睾酮的水平显著下降。其发现，男性性成熟度评分与年龄成正相关，而与硫丹水平成负相关，这说明硫丹具有雄性生殖毒性。

3.2.1.3 致畸、致癌和致突变 OCPs

可以通过胎盘屏障进入胎儿体内，部分品种及其代谢产物有一定致畸性，使用此类农药较多的地区的畸胎率和死胎率比使用此类农药较少的地区高 10 倍左右[48]。某些 OCPs 可损伤 DNA，引起基因突变。NAGAYAMA J 等[56]对日本 101 名 10 个月大的婴儿进行调查发现，孕妇产前暴露于滴滴涕等农药会影响婴儿的免疫系统，导致基因突变。农药作为潜在的化学致癌物质可能参与癌症的发生。流行病学调查发现，多种癌症的发生可能同接触 OCPs 密切相关：GASULL M 等[57]研究发现，日常食用含有 p,p'-DDT、p,p'-DDE 的食物会导致胰腺癌的发生；ANAND M 等[58]做了一项病例对照研究，发现乳腺癌患者脂肪组织中 p,p'-DDT、o,p'-DDT 的水平比普通妇女的高，表明 OCPs 与乳腺癌的发生呈正相关关系。

3.3 氨基甲酸酯类禁用农药

氨基甲酸酯类农药是结构中含有氨基甲酸基团的酯类化合物，属于尿素的衍生物。它的结构通式见图 3。

其中 R1、R2 代表甲基、氢、酰基或烃硫基；R3 代表肟基、芳香基、取代芳香基或烯醇结构的杂环。氨基甲酸酯杀虫剂可根据 R1、R2和 R3取代基团结构的不同分为 N-甲基氨基甲酸酯类、N,N′-二甲基氨基甲酸酯类和硫代氨基甲酸酯类等化合物。《中国药典》2020 年版禁用的 33 种农药中氨基甲酸酯类农药包括克百威和涕灭威。其中，克百威是 R3 为芳香基取代的 N-甲基氨基甲酸酯类农药，涕灭威是 R3为肟基取代的 N-甲基氨基甲酸酯类农药。氨基甲酸酯类禁用农药的“致畸、致癌、致突变”问题也受到国际社会的日益关注[59]，此类农药可以使很多动物导致畸性并会引起免疫失调。FUKUYAMA T 等[60]研究发现直接免疫毒性、内分泌干扰和抑制酯酶活性是氨基甲酸酯类农药引起免疫失调的主要机制，并认为这可能是引起过敏性鼻炎和支气管伴随着哮喘疾病的原因。最新研究表明，此类杀虫剂具有潜在的肝脏毒性，可诱导氧化应激，损害肝功能[61]。

3.4 其他类农药

3.4.1 脒类农药

脒类农药是一种广谱杀虫和杀螨剂。《中国药典》2020 年版禁用脒类农药包括杀虫脒。脒类农药作为一种神经性毒物，急性中毒可以导致心血管系统的损伤；慢性中毒可以导致白细胞增加，血红蛋白和血细胞计数下降等症状。长期职业接触脒类农药的工人多数都会出现咽喉不适、多痰等慢性中毒的症状，并伴有头晕、乏力，失眠等神经衰弱症候状群。同时，脒类农药还可以导致癌症的发生和 DNA 的损伤。研究发现用小鼠皮敷杀虫脒一段时间后，其皮肤出现了表皮增生、乳头状瘤、生鳞状细胞癌等一系列病变，其发生率与杀虫脒剂量成正相关，研究结果证实杀虫脒及其代谢产物（4-氯邻甲苯胺）有致癌作用[62]。我国农药毒理研究所用杀虫脒进行的 Ames 诱变试验和 DNA 修复合成试验，均获得阳性结果，说明杀虫脒及其代谢产物（4-氯邻甲苯胺）对 DNA 有损伤和致突变作用[63]。

3.4.2 磺酰脲类农药

《中国药典》2020 年版磺酰脲类禁用农药包括甲磺隆、氯磺隆和胺苯磺隆。磺酰脲类除草剂分子结构由芳环、磺酰脲桥和杂环 3 个部分组成，作用机制为通过抑制乙酰乳酸合成酶而发挥除草作用。磺酰脲类除草剂具有高效、广谱、低毒、高选择性等特点，但因在土壤中残留时间较长，微量残留即可对后茬作物造成危害[64]。

3.4.3 苯基吡唑类农药

《中国药典》2020 年版禁用苯基吡唑类农药包括氟虫腈。相关研究证明，氟虫腈对动物及人类具有亚致死作用[65]。经皮肤和呼吸道吸收后能够引起中毒，产生结膜炎、情绪躁动、癫痫和精神异常等现象[66]。除此之外，氟虫腈还可被降解成毒性更大的代谢物，其中氟虫腈砜对虹鳟的毒性是其母体的 6.3 倍[67]；对于淡水无脊椎动物，氟虫腈亚砜的毒性是其母体的 1.9 倍[68]；氟甲腈性质非常稳定，与氟虫腈相比对动物的毒性更大[69]。

3.4.4 醚类农药

禁用农药中除草醚属于二苯醚类除草剂，由于对水生动物低毒，自 20 世纪 60 年代迅速取代五氯酚钠用于稻田除草，在我国稻田除草中曾起过重要作用。但随着动物试验的深入，现已明确除草醚对哺乳动物具有致癌、致畸、致突变作用，且经皮吸收远比经口吸收作用更强烈，而经皮吸收是人体接触除草醚最可能的途径，危险性较大。禁用农药的毒性主要包括神经毒性、生殖毒性、免疫系统毒性及致畸、致癌、致突变等作用，对人和动物的健康危害较大。在中药的种植和储存过程中，应按照要求禁止这些农药的使用。因此，建立适用于中药材中禁用农药残留样品前处理和分析检测方法变得尤为重要。

4 中药材中禁用农药的分析方法

检测中药材中禁用农残为痕量分析，往往受其复杂的基质（如色素、油脂、杂质等）干扰，这对建立高效、灵敏的检测方法提出了更高的要求。笔者从中药基质中禁用农药残留样品前处理和分析检测方法两方面进行介绍。

4.1 样品前处理

对于禁用农药残留检测，样品的前处理过程是决定检测结果准确性的关键，应最大程度降低干扰，进行目标化合物的提取。目前常用的中药中禁用农药残留样品前处理方法为固相萃取技术、 QuEChERS 法、凝胶渗透色谱技术、微波萃取技术等。

4.1.1 固相萃取技术

固相萃取（solid phase extraction，SPE）技术[70]主要通过优化样品在吸附剂与溶剂中溶解度及功能团的相互作用来影响样品的滞留与洗脱，从而达到目标物与干扰物分离的目的。由于其操作简便快速、有机溶剂用量少且环境污染小，在中药禁用农药残留分析的样品前处理中得到了广泛的应用[71]。吴丽苹等[72]将人参用丙酮提取后，经固相微萃取技术对提取液进行萃取，在最优萃取条件下，建立人参中克百威等农药的 GC-MS 分析方法，LOD 为 0.001~0.010 mg·kg-1，该方法具有较高的准确度和灵敏度，可用于实际样品中的农残分析。李嘉欣等[26]建立了金银花中 23 种禁限用有机磷农药残留的分析方法，如甲胺磷、灭线磷、久效磷、硫线磷、治螟磷等，由于检测样本量大，且金银花色素及有机酸含量高，选用 Carb/NH2 SPE 柱进行净化，效果良好。TONG Y L 等[73]验证了 C18-Carb/NH2 SPE 和 GC-MS/MS 分析方法的有效性，并将其应用于中药菊花样品中甲胺磷、久效磷等 100 种农药残留的同时测定。

4.1.2 QuEChERS 法

QuEChERS 法是一种基于 SPE 的样品前处理技术，可有效避免液-液分配中出现的乳化现象，减少有机溶剂用量，缩短前处理时间[74]。QuEChERS 法可分为提取和净化 2 个步骤。提取步骤中使用无水硫酸镁来帮助提取，同时也使用氯化钠或无水乙酸钠用于“对碱敏感的化合物”的提取。净化过程中采用 N-丙基乙二胺（PSA），以去除有机酸和极性色素；有些搭配使用 C18 填料，以去除脂类和甾醇，或使用石墨化炭黑减少色素的干扰。李安平等[75]分别比较了 SPE 及 QuEChERS 法作为当归基质的前处理方法，通过考察基质对甲胺磷、灭线磷等禁用农药峰形的改善及加标回收率，最终选择了 QuEChERS 法作为前处理方法。耿昭等[76]采用 QuEChERS 法对样品进行前处理，结合气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）建立了对贝母类中药中苯线磷、甲胺磷等 53 种农药残留的检测方法，回收率较高。WEI J C 等[77]建立了 QuEChERS-分散液-液微萃取联合使用的前处理方法测定黄芪中磷胺等 5 种有机磷农药的方法，具有重复性、回收率良好的特点。

4.1.3 凝胶渗透色谱技术

凝胶渗透色谱法（gel permeation chromatography，GPC）主要利用样品中各组分相对分子质量的大小不同，从而在凝胶中保留时间不同而达到分离的目的，用于样品中高相对分子质量干扰物的去除，尤其是对富含脂肪、色素等大分子杂质样品的分离净化效果明显。该方法提取效率高、省时、经济，适用于常规大量样品分析，广泛应用于中药禁用农药残留分析中脂类提取物与农药的分离[78]。尹秀莲等[79]建立了基于 GPC 技术的枸杞中对硫磷等 7 种有机磷农药残留的气相色谱检测方法，平均回收率在 79.30%~109.3%，准确度、精密度良好，可用于定性定量分析。

4.1.4 微波萃取技术

微波萃取技术（microwave assisted extraction，MAE）为利用微波来提高萃取效率的一种新型萃取分离前处理技术。MAO X J 等[80]通过优化 MAE 条件，结合气相色谱质谱联用技术建立了黄芪中有机氯、有机磷及氨基甲酸酯类等 27 种农药的检测方法。WAN Y Q 等[81]将 MAE 与气相色谱联用，对中药材中 16 种有机磷农药进行检测，结果检测出市场上菊花、苦杏仁、白芥子中有治螟磷等农药残留，表明该方法可实现中药材中对目标化合物的有效提取和检测。

4.2 检测技术

为了应对农药残留检测要求，越来越多的学者致力于开发先进的分析技术和手段，旨在建立高通量快速等农残检测方法，以适应于不同样品的分析需求。目前主要应用于禁用农药残留的检测技术为气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法、液相色谱-串联质谱法和免疫分析法等。

4.2.1 色谱法

目前，应用于禁用农药残留的检测技术以气相色谱（gas chromatography，GC）和液相色谱（liquid chromatography，LC）为主。GC 作为禁用农药残留检测的主要分析手段，可根据待测农药的结构及其所含元素的不同选择相应的检测器，如电子捕获检测器（ECD）对含卤素的化合物敏感，氮磷检测器（NPD）对含氮和磷的有机物敏感，火焰光度检测器（FPD）则对含硫和磷的物质敏感[82]。顾炎等[10]利用 FPD 建立了金银花中治螟磷、水胺硫磷等 54 种有机磷农药残留的 GC 检测方法，结果显示 LOQ 小于 0.05 mg·L-1，在 0.05~0.5 mg·L-1 呈现良好的线性关系。周国威等[83]采用 GC-ECD 同时检测荆芥中六六六、滴滴涕等 22 种有机氯农药，该方法 LOQ 为 0.003~0.026 mg·kg-1，平均回收率为 75.20%~110.3%。LC 适用于更宽极性范围、不易挥发、热不稳定的化合物分离，分离效率高，分析速度快。主要用于极性强、难挥发、沸点高且高温下易分解的农药残留检测，常用的检测器主要有紫外检测器（UV）、二极管阵列检测器（DAD）和荧光检测器（FD）[84]。谭君等[85]建立了基质固相分散-高效液相色谱法（MSPD-HPLC）对人参中的甲胺磷、甲基对硫磷等有机磷农药残留进行快速分析，线性范围为 0.20~10.00 mg·L-1，LOD 低于 0.017 mg·L-1，样品的加样回收率为 87.29%~92.43%，均满足有机磷农药残留分析的要求。

4.2.2 色谱-质谱联用法

由于单一的色谱技术无法满足农药异构体、同系物、代谢物及多类农药残留同时分析的需要，近年来色谱-质谱联用技术逐渐成为农药残留分析的常用方法。该方法结合了色谱的高分离能力及质谱准确鉴定化合物结构的特性，适用于多农药残留的同时定性、定量分析[82]。目前，应用于多禁用农药残留的色谱 - 质谱联用检测技术主要为气相色谱 - 串联质谱法（ gas chromatography-tandem mass spectrometry ， GC-MS/MS ）和液相色谱 - 串联质谱法（ liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）。GC-MS/MS 主要针对难以区分的热稳定且易挥发的同分异构体的分离鉴定，根据农药分子的特征结构碎片，准确鉴别未知的农药化合物，节省了逐个单标匹配进样的时间，大大提高了分析效率。赵志高等[27]运用 GC-MS/MS 建立了同时定量分析甘草药材和饮片中禁限用有机氯农药的检测方法，并对 32 批次的实际样品进行检测，其中 6 批次检出 β-硫丹、o,p'-DDD 等，但均未超标。金美奇[25]等采用乙腈提取、QuEChERS 净化的前处理方法，建立了 GC-MS/MS 方法，对收集的 41 批山楂样品进行农药残留检测，p,p′-DDD、p,p′-DDE 等均有检出。LC-MS/MS 可实现复杂样品中农药的有效分离、定性和定量检测，主要用于高沸点、热稳定性差的多组分农药残留分析[86]。CHEN L 等[87]采用 LC-MS/MS 的方法建立了中药材中克百威、氟虫腈等 53 种农药残留的检测方法，并对基质进行了分类与代表性的选择。郭晓霞等[88]采用 QuEChERS 方法结合 UPLC-MS/MS 测定了紫花地丁中 82 种农药多残留，包括涕灭威、克百威等。

4.2.3 免疫分析法

免疫分析技术（immunoassay，IA）主要利用抗原与抗体的高特异性，对样品中农药残留进行分析，实现农药残留的现场快速检测。在禁用农药残留分析中常用的免疫分析方法有酶联免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法、免疫层析法和生物传感器免疫分析法几种[89]，其原理见图 4。

4.2.3.1 酶联免疫分析法

酶联免疫分析技术（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是目前禁用农药残留分析检测中应用最为广泛的免疫分析技术，该方法基于抗原或抗体与固相载体（如聚氯乙烯或聚苯乙烯板）的结合及酶（辣根过氧化物酶等）的标记，检测灵敏度较高[90]。根据待测物不同可分为非竞争型和竞争型 ELISA，农药作为小分子主要采用竞争型 ELISA 进行测定，如有机磷、有机氯、氨基甲酸酯等类禁用农药。其中竞争 ELISA 又包括了间接竞争 ELISA（icELISA）和直接竞争 ELISA（dcELISA）。dcELISA 可以标记抗原和抗体，操作简便，但方法需要的抗体量往往较多。icELISA 直接用标记二级抗体来识别，可以加强信号，能够保留较多的免疫反应性[91]。在禁用农残检测中，dcELISA 及 icELISA 都有应用。LIU Y H[92]等建立了一种适合于现场高通量检测的 icELISA 分析方法，用于检测土壤及农产品中对硫磷的含量，经仪器方法验证，灵敏度较高。

4.2.3.2 荧光免疫分析技术

荧光免疫分析技术（fluorescent immunoassay，FIA）主要借助不同的荧光素作为标记物修饰在抗原、抗体上进行分析检测。主要包括荧光标记免疫分析（ fluorescence labeled immunoassay，FLISA）、时间分辨荧光免疫分析（time resolved fluoro immunoassay，TRFIA）和荧光偏振免疫分析（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）等。FLISA 原理与 ELISA 类似，将标记物换成了荧光物质，具有较高的灵敏度且操作简单。但目前该方法的应用仍存在一定局限性，在禁用农药残留检测方面少有报道。TRFIA 在有机磷和氨基甲酸酯类禁用农药检测中应用较多[89]，该方法有效地降低了本底瞬时荧光的干扰，灵敏度和准确性较其他荧光免疫方法更高并可实现多标记检测。FPIA 主要用于小分子化合物的检测，反应速度较快，但灵敏度较低，仍有很大的发展空间。TANG J 等[93]建立了一种 FPIA 方法应用于对硫磷等分析检测，其检测灵敏度为 0.179 mg·L-1，该方法相对于 ELISA 更加快速、简便，更利于现场化快速检测。

4.2.3.3 化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术（chemiluminescent immunoassay，CLIA）主要将免疫分析的特异性与化学发光的高灵敏性相结合，将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，通过测定化学发光强度对待测物进行定量分析，灵敏度较高[94]。该方法特异性强，检测速度相对较快，操作简单，可实现自动化且费用较低，但需要寻找到合适的发光标记物。根据标记物的不同，CLIA 可分为发光物质直接标记的化学发光标记免疫分析、化学发光酶免疫分析（CLEIA）和电化学发光免疫分析（ECLIA）。张峰等[95]以鲁米诺和过氧化氢作为化学发光底物，建立了 CLIA 法检测 DDT，最低检测限可达 0.05 ng·mL-1。邹茹冰等[96]基于同时识别对硫磷、甲基对硫磷和杀螟硫磷 3 种农药的宽谱特异性抗体，建立了一种同时检测这 3 种农药的 CLEIA 方法，IC50分别为 5.43、1.34、1.24 μg·kg-1，方法的线性和灵敏度良好。总体而言，CLIA 法相较 ELISA 法灵敏度更高，在农药检测领域已得到广泛应用，且具有良好的发展前景。然而，由于发光标记物在发光达到顶峰衰减后发光值不稳定，导致 CLIA 法的批内批间变异系数较高。因此，有效解决化学发光标记物发光稳定性问题将进一步推动 CLIA 法在禁用农药残留检测领域中的应用。

4.2.3.4 免疫色谱技术

免疫色谱技术（immunochromatography assay，ICA）为一种将抗原与抗体的特异性与色谱技术相结合的检测技术。以待测物溶液为流动相，反应后标记物会在显色带聚集显色，通过显色情况进行定性定量，标记物的灵敏度对于免疫色谱技术十分重要[97]。根据使用的标记物不同将免疫色谱技术分为胶体金免疫技术、荧光免疫色谱技术、量子点色谱技术、荧光微球色谱技术、时间分辨荧光免疫色谱技术、磁珠免疫色谱技术、适配体色谱技术。与其他免疫技术相比，胶体金免疫技术在禁用农药中应用较多，其操作简单，不需要特定的检测设备，检测速度快，一般点样后 15 min 以内即可判定结果，因此特别适用于现场快速检测。但是与 ELISA 等方法相比，其灵敏度较低，目前多以定性和半定量检测为主。基于甲基对硫磷和吡虫啉 2 种农药发光信号出峰时间的差异，SHU Q 等[98]将免疫色谱试纸条与时间分辨化学发光法结合，实现了农药残留的定量检测，线性范围均为 0.1~250 ng·mL-1，检出限为 0.058 ng·mL-1，线性和灵敏度良好，该方法已成功应用于甘草和当归等实际样品的检测。

4.2.3.5 免疫传感器法

免疫传感器法（immunosensor）是将高特异性的免疫分析技术与高灵敏性的传感器技术相结合的一种方法，抗原抗体作为识别系统，传感器作为信号放大系统，大大提高了免疫分析的灵敏度，实现了免疫分析技术的定量分析和自动化操作[89]。TANG T 等[99]通过将量子点与经过氨基修饰的核苷酸偶联，并与有机磷农药的 DNA 适配体特异性结合，利用激光诱导的毛细管电泳进行分析检测，目前已成功用于甲拌磷、水胺硫磷等禁用农药的测定。

5 结论与展望

本文对《中国药典》2020 年版中 33 种禁用农药的残留现状、毒性和检测方法进行了系统的综述。因监管制度尚不成熟，禁用农药的毒性作用仍对人体及环境产生一定的危害，需加强执法监督力度，并对禁用农药毒理学进行进一步的研究，这对后期全面的风险评估有着至关重要的作用。随着色谱质谱联用等技术的不断发展，目前已相对成熟的应用于中药中农药残留的检测分析，但如何开展中药更为简便、多元化的样品前处理技术，仍是值得继续探索开发的方向。免疫分析技术也正朝着更高灵敏度、实时在线检测、现场快速检测、多组分同时检测和便携微型化的方向快速前进。尽管如此，现有的免疫分析技术大多数局限于水溶液或简单基质中农残检测，对于复杂的中药基质仍有许多应用局限性，有待进一步开发研究。未来中药材种植栽培将向着绿色种植、规范化种植的方向发展，科学合理使用农药，使用低毒、环保、易降解农药及农药减量使用已成为必然趋势。

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https://doi.org/10.19540/j.cnki.cjcmm.20211014.202

来源：同茂顺

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