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利用组培苗叶片快速繁育大花绣球无尽夏的方法与流程

花匠小妙招
2024-11-13 19:59

本发明涉及一种利用无菌组培苗叶片通过愈伤分化不定芽途径快速繁育大花绣球‘无尽夏’的方法，属于农业生物技术领域。

背景技术：

绣球花[hydrangeamacrophylla(thunb)ser.]又名八仙花、紫阳花等，为虎耳草科八仙花属(即绣球花属)观赏灌木。绣球原产于日本以及中国四川一带，现世界现各地均有栽培，中国主要分布于长江流域以南各省地区。绣球花不仅观赏效果好而且耐阴，既能作盆花栽培，又可种植于庭院、公园、绿地，是园林中重要的观赏植物，在园林绿化、美化中应用广泛，种苗需求量大。同时绣球花在医学上也有很高的药用价值，研究发现其叶片含有绣球酚和绣球酚-8-o-β-d-葡萄糖糖苷等成分以及甘茶叶素等物质,能够促进3t3-l1细胞脂肪生成。

优良绣球品种‘无尽夏’是绣球的一个变种，它与其它绣球品种最大的区别在于花期相对较长。佛罗里达大学的学者研究发现‘无尽夏’的花期比普通的绣球花平均要长10-12周，并且忍受低温的能力比普通绣球花要强，在较冷的环境中也能开花。

目前，‘无尽夏’主要靠扦插、分株和压条等方法繁殖，不仅耗材多、繁殖系数低、繁殖周期长，还受生长季节和繁殖材料的限制，无法满足规模化生产和市场的需要。因此，亟待采取有效的方法对‘无尽夏’加以繁殖，使之能够规模化生产，满足人们日益增长的需求。

利用植物组织培养技术繁殖‘无尽夏’可以不受环境条件和季节等因素的限制，具有周期短,可控性强，繁殖系数高等优点，可在短时间内得到大规模整齐的瓶苗，是解决上述难题的重要途径。但是，到目前为止，未发现有关于大花绣球‘无尽夏’组培快繁方面的报道。

目前有关绣球花组培快繁的研究均以茎尖和腋芽增殖培养为主。根据现有文献的报道，发明人经过反复实验发现，以诱导和培养嫩茎段腋芽丛生的方式建立的快繁体系繁殖系数不高，也不能作为农杆菌介导的遗传转化体系对‘无尽夏’进行遗传改良。近年来也有通过叶片直接分化不定芽的报道。liu等(2011)以大花绣球‘hyd1’无菌苗叶片为外植体，在b5为基本培养基，附加6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l的固体培养基上可直接诱导产生不定芽，不定芽诱导率为100％，平均不定芽数为2.7个(liuf,huangll,liyl,etal.shootorganogenesisinleafexplantsofhydrangeamacrophylla‘hyd1’andassessinggeneticstabilityofregenerantsusingissrmarkers.plantcelltissorgancult,2011,104:111–117)。latifa等(2011)以大花绣球‘blaumeise’无菌苗叶片为外植体，低光照下在b5+6-ba10μm+naa0.5μm++110mm麦芽糖固体培养基上不定芽诱导率为86％，栎叶绣‘snowqueen’在ms+6-ba1.0mg/l固体培养基上不定芽诱导率为44％，但报道没有调查叶片诱导的平均不定芽数(latifah,lindav,didierp,etal.shootregenerationandgenetictransformationbyagrobacteriumtumefaciensofhydrangeamacrophyllaser.leafdiscs.scientiahorticulturae,2011,127:378–387)。根据以上采用绣球叶片直接诱导不分化定芽的文献报道，发明人经过反复实验发现，上述报道的培养基和培养条件并不适用大花绣球‘无尽夏’，‘无尽夏’组培苗叶片在上述条件下不定芽诱导率和平均不定芽数均很低。

范晓峰等使用八仙花茎段、叶柄和叶片作为外植体，发现诱导它们产生愈伤组织的最佳培养基为ms+6-ba1.0～2.0mg/l+naa0.50mg/l，其中叶柄的培养效果最好，诱导率最高达87.5％，而叶片的诱导效果最差，诱导率仅为47.1％(范晓峰,杨建霞,杨颖丽.八仙花愈伤组织诱导与快速繁殖[j].经济林研究,2009,27(1):41-44)。ruffoni等(2013)报道栎叶绣球‘snowqueen’叶片在ms+2,4-d0.5mg/l+kt0.5mg/l或ms+2,4-d0.15mg/l固体培养基上愈伤组织的诱导率为100％(ruffonib,saccoe,savonam.invitropropagationofhydrangeaspp.,2013,11013:231-244)。根据以上诱导绣球叶片产生愈伤组织的文献报道，发明人经过反复实验发现，上述报道的培养基和培养条件并不适用大花绣球‘无尽夏’，‘无尽夏’组培苗叶片在上述条件下的愈伤诱导率都比较低。

技术实现要素：

本发明的目的在于：针对目前人们如何利用组织培养技术快速繁育大花绣球‘无尽夏’并对其进行遗传改良存在的技术空白，提供一种利用组培苗叶片快速繁育大花绣球‘无尽夏’的方法。

本发明的目的是这样实现的：

一种利用组培苗叶片快速繁育大花绣球‘无尽夏’的方法，其特征在于，利用无菌组培苗叶片形成愈伤，通过愈伤分化不定芽途径快速繁育大花绣球‘无尽夏’，具体步骤如下：

a)剪取‘无尽夏’无菌组培苗顶生第三到第六个叶片，对叶片垂直于主脉切割一刀并去除叶柄和叶稍；

b)将叶片置于愈伤诱导培养基上，暗培养15～25天后进行光照培养；

c)光照培养40天后，将带愈伤的叶片转到愈伤增殖与不定芽诱导培养基上进行继代培养，40天后形成丛生芽；

d)将丛生芽切分，转移到不定芽生长培养基上进行伸长生长，30天后形成幼苗；

e)将幼苗切下，转移到成苗与生根培养基上，30天后，幼苗发育成具有根、茎、叶的完整再生植株。

进一步，在所述利用组培苗叶片快速繁育大花绣球‘无尽夏’的方法中，所述培养基配方如下：

愈伤诱导培养基：ms培养基中加入终浓度为3.0mg/l的细胞分裂素n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲cppu、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30mg/l的蔗糖；

愈伤增殖与不定芽诱导培养基：ms培养基中加入终浓度为1.0～2.25mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l蔗糖；

不定芽生长培养基：ms培养基中加入终浓度为1.0mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l蔗糖；

成苗与生根培养基：ms培养基中加入终浓度为0.5mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l蔗糖；

上述培养基均以ms培养基为基础，它们均在高压灭菌前用氢氧化钠和盐酸调整ph值至5.8。

进一步，在所述利用组培苗叶片通过愈伤分化不定芽途径快速繁育‘无尽夏’的方法中，所述光照培养是指，光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为25±2℃。

进一步，在所述利用组培苗叶片快速繁育大花绣球‘无尽夏’的方法中：步骤a所述“无尽夏”无菌组培苗是这样获得的：剪取“无尽夏”当年带有4～6个侧芽的新发枝条5～7cm通过组织培养后获得‘无尽夏’无菌组培苗。

进一步，在所述利用组培苗叶片快速繁育大花绣球‘无尽夏’的方法中：所述的组织培养是指：对剪取的新发枝条用洗衣粉水洗刷干净，流水冲洗2～3小时，无菌条件下，先用70％的酒精浸30秒；再用0.1％的hgcl2消毒10分钟，无菌水冲洗4～6次后，接种到ms固体培养基上；30天后将获得的无菌苗切成2cm且含有2个侧芽的茎段转接到ms+6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l培养基上进行增殖；30天后再将增殖的芽转接到ms+6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l培养基上进行壮苗的全过程。

本发明的优点在于：本发明在前人研究基础上，采用‘无尽夏’无菌组培苗顶生第三至第六个叶片为外植体材料，通过研究叶位、暗培养时间及激素组合等因素对叶片愈伤形成及愈伤分化不定芽的影响等关键技术问题，建立了‘无尽夏’快速、高效的繁殖体系，大幅度提高了繁殖系数，缩短了繁殖周期，有效地满足人们对‘无尽夏’日益增长的需求；同时本发明的快繁体系也可以作为农杆菌介导的遗传转化体系对‘无尽夏’进行遗传改良。因此，本发明具有较大的科研价值和经济价值。

本发明的优点还在于：通过采用‘无尽夏’无菌组培苗叶片诱导愈伤组织，再由愈伤组织分化不定芽，避免了‘无尽夏’组织培养过程中外植体需要灭菌、污染率高等问题。

附图说明

图1为组培苗叶片诱导产生愈伤示意图片。

图2为愈伤分化丛生芽示意图片。

图3为不定芽伸长示意图片。

图4为不定芽长成幼苗示意图片。

图5为组培苗生根培养示意图片。

具体实施方式

下面将结合附图实施例详细说明本发明所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质，但不能对本发明的实施和保护范围构成任何限定。

实施例涉及材料来源：

‘无尽夏’盆栽苗由江苏省农业科学院休闲农业研究所观赏植物研究室提供；ms培养基、蔗糖和琼脂，以及细胞分裂素n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲(n-(2-chloro-4-pyridyl)-n'-phenylurea，简称cppu)、激动素(kinetin，简称kt)、玉米素(zeatin，简称zt)、6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，简称6-ba)和生长素萘乙酸(1-naphthylaceticacid，简称naa)、吲哚丁酸(3-indolebutyricacid，简称iba)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，简称2,4-d)均购自南京鼎国生物技术有限公司；细胞分裂素噻苯隆(thidiazuron)简称tdz，购于南京生兴生物技术有限公司；

愈伤诱导培养基：ms培养基中加入终浓度为3.0mg/l的细胞分裂素n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲cppu、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30mg/l的蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整ph值至5.8，高压灭菌；

愈伤增殖与不定芽诱导培养基：ms培养基中加入终浓度为1.0～2.25mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整ph值至5.8，高压灭菌；

不定芽生长培养基：ms培养基中加入终浓度为1.0mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整ph值至5.8，高压灭菌；

成苗与生根培养基：ms培养基中加入终浓度为0.5mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整ph值至5.8，高压灭菌；

实施例1

1、‘无尽夏’无菌组培苗的获得与增殖

剪取‘无尽夏’5～7cm长当年新发枝条(带有4～6个侧芽)，用洗衣粉水洗刷干净，流水冲洗2～3小时。无菌条件下，先用70％的酒精浸30秒，再用0.1％的hgcl2消毒10分钟，无菌水冲洗4～6次后，接种到ms固体培养基上，30天后将获得的无菌苗切成约2cm(带有2个侧芽)的茎段转接到ms+6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l培养基上进行增殖，30天后再将增殖的芽转接到ms+6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l培养基上进行进行壮苗。

2、叶位对叶片诱导愈伤的影响

分别剪取步骤1中‘无尽夏’无菌组培苗形态学的3和4位、5和6位、7和8位、9和10位叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于愈伤诱导培养基上，培养室温度为25±2℃(该温度为暗培养和光培养温度)，暗培养20天后进行光照培养，光照培养40天(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)后统计叶片愈伤诱导率并调查愈伤生长情况。其结果如表1所示：

表1‘无尽夏’组培苗不同叶位叶片诱导愈伤的比较

注：+一般；++较好；+++旺盛.

表1结果表明，采用‘无尽夏’组培苗不同叶位的叶片作为外植体，愈伤诱导率和愈伤生长状态存在一定差异，其中，第3至第6位叶的愈伤诱导率显著高于其他叶位愈伤诱导率，基本达到100％，而且愈伤生长旺盛；第7和第8位叶片的愈伤诱导率为82.5％，而第9和第10位叶片的愈伤诱导率仅为55.3％。综合分析表1结果显示，‘无尽夏’组培苗植株中上部叶片的愈伤诱导效果明显优于下部叶片，第3至第6位叶片为适宜的外植体取样叶位。

3、暗培养时间对叶片诱导愈伤的影响

剪取步骤1中‘无尽夏’无菌组培苗顶生第三至第六个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于愈伤诱导培养基上，分别进行0、5、10、15、20、25和30天七个时间点的暗培养处理。处理完后将其置于光照环境中继续培养，每个处理培养满60天后统计叶片愈伤诱导率并调查愈伤生长情况。处理结果如表2所示：

表2暗培养时间对‘无尽夏’组培苗叶片诱导愈伤的影响

注：+一般；++较好；+++旺盛.

表2结果表明暗培养对‘无尽夏’组培苗叶片愈伤的诱导有一定促进作用；暗培养为15～25天，叶片愈伤的诱导率在98％以上，且叶片愈伤的生长量和愈伤生长状态明显优于其它处理。因此，‘无尽夏’叶片外植体最佳暗培养时间为15～25天。

4、不同植物生长调节剂对叶片诱导愈伤的影响

剪取步骤1中‘无尽夏’无菌组培苗顶生第三至第六个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于包含不同激素组合的ms培养基上：zt(2.25mg/l)、kt(2.25mg/l)、6-ba(2.25mg/l)和cppu(2.25mg/l)与分别iba(0.1mg/l)组合。培养室温度为25±2℃(该温度为暗培养和光培养温度)，暗培养20天后进行光照培养，光照培养40天(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)后统计叶片分化率。结果如表3所示：

表3不同激素配比对‘无尽夏’组培苗叶片分化的影响

表3结果表明，在基本培养基(ms)和培养条件相同的情况下，接种于激素配比终浓度为zt2.25mg/l+iba0.1mg/l和kt2.25mg/l+iba0.1mg/l培养基上的叶片外植体既不能再生不定芽，也不能诱导形成愈伤；接种于激素配比终浓度为6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l培养基上的叶片可以直接再生不定芽，但再生率仅为15.6％；接种于激素配比终浓度为cppu3.0mg/l+iba0.1mg/l培养基上的叶片可以诱导产生愈伤，诱导率高达99.5％。

根据表3研究结果，剪取步骤1中‘无尽夏’无菌组培苗顶生第三至第六个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于包含不同激素组合的ms培养基上(见表4)，进一步优化诱导叶片产生愈伤的培养基。培养室温度为25±2℃(该温度为暗培养和光培养温度)，暗培养20天后进行光照培养，光照培养40天(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)后统计叶片愈伤诱导率并调查愈伤生长情况。结果如表4所示：

表4不同激素配比对‘无尽夏’组培苗叶片诱导愈伤的影响

注：+一般；++较好；+++旺盛

表4结果可见，在基本培养基(ms)和培养条件相同的情况下，cppu诱导叶片产生愈伤的效果远优于2,4-d，叶片在cppu+iba(或naa)激素组合培养基上的愈伤诱导率均在95％以上。叶片在含激素配比终浓度为cppu3.0mg/l+iba0.1mg/l和cppu3.0mg/l+iba0.5mg/l培养基上愈伤长势最好，但在含激素配比终浓度为cppu3.0mg/l+iba0.5mg/l培养基上产生的愈伤有少部分玻璃化现象。综合表3和表4结果，诱导‘无尽夏’叶片产生愈伤的最佳培养基为ms+cppu3.0mg/l+iba0.1mg/l(如图1所示)。

5、不同植物生长调节剂对诱导愈伤分化不定芽的影响

从在愈伤诱导培养基上暗培养20天后，继续进行光照培养40天的叶片上切下愈伤组织，转到如表5所示激素组合的ms培养基上进行继代培养，40天后调查不定芽诱导率和平均不定芽数，结果如表5所示：

表5不同激素配比对诱导愈伤分化不定芽的影响

由表5结果可见，在基本培养基(ms)和培养条件相同的情况下，接种于激素配比终浓度为tdz1.0mg/l+iba0.1mg/l、6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l和6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l三种培养基上的愈伤诱导不定芽再生率没有显著差异，显著高于其它两种激素配比；但在激素配比终浓度为tdz1.0mg/l+iba0.1mg/l培养基上的愈伤分化平均不定芽数显著少于激素配比终浓度为6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l和6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l两种培养基，且分化的不定芽部分玻璃化。因此诱导愈伤分化不定芽的最佳培养基为ms+6-ba1.0～2.25mg/l+iba0.1mg/l(如图2所示)。

6、不定芽伸长生长：

将在愈伤增殖与不定芽诱导培养基上光照培养(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d；培养室温度为25±2℃)40天产生的不定芽切分后转接到不定芽生长培养基上进行继代(如图3所示)，30天后形成幼苗(如图4所示)。

7、成苗和生根培养

将步骤6培养30天后形成的幼苗切下转移到成苗和生根培养基上，培养30天后，幼苗发育成具有根、茎和叶的完整小植株(如图5所示)，生根率达95％以上。

成苗后如果不适宜大田栽培，可以移入温室或大棚，待机再移出。

实施例2

1、‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’3个大花绣球品种无菌组培苗的获得与增殖

分别剪取‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’5～7cm长当年新发枝条(带有4～6个侧芽)，用洗衣粉水洗刷干净，流水冲洗2～3小时。无菌条件下，先用70％的酒精浸30秒，再用0.1％的hgcl2消毒10分钟，无菌水冲洗4～6次后，接种到ms固体培养基上，30天后将获得的无菌苗切成约2cm(带有2个侧芽)的茎段转接到ms+6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l培养基上进行增值，30天后再将增殖的芽转接到ms+6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l培养基上进行进行壮苗。茎段增殖培养基ms+6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l和壮苗培养基ms+6-ba1.0mg/l+iba0.1mg/l对于大花绣球的三个品种‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’的茎段增殖扩繁均适用，茎段增殖系数一般3～5，壮苗后的叶片能供下面步骤2和步骤3的平行试验使用。

2、‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’3个大花绣球品种在直接诱导叶片分化不定芽培养基上的平行试验

据liu(liuf,huangll,liyl,reinhoudp,jongsmama,wangcy.shootorganogenesisinleafexplantsofhydrangeamacrophylla‘hyd1’andassessinggeneticstabilityofregenerantsusingissrmarkers.plantcelltissorgancult,2011,104:111–117)和latifa(latifah,lindav,didierp,etal.shootregenerationandgenetictransformationbyagrobacteriumtumefaciensofhydrangeamacrophyllaser.leafdiscs.scientiahorticulturae,2011,127:378–387)报道，大花绣球品种‘hyd1’和‘blaumeise’的叶片在b5+6-ba2.25mg/l+iba0.1mg/l培养基上可不经过愈伤阶段直接产生不定芽。

叶片诱导不定芽培养基：b5培养基中加入终浓度为2.25mg/l的细胞分裂素6-苄氨基嘌呤6-ba、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l的蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整ph值至5.8，高压灭菌。

分别从本实施例步骤1获得的‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’无菌组培苗中剪取顶生第三至第六个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于不定芽诱导培养基上，培养室温度为25±2℃，暗培养10天后进行光照培养(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)，50天后统计叶片不定芽诱导率和平均不定芽数，结果如表6所示：

表6‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’3个大花绣球品种在直接诱导叶片分化不定芽培养基上的平行试验

表6显示大花绣球品种“艾薇塔”组培苗叶片直接再生不定芽的频率高达4.6％，平均再生不定芽数为8.9；大花绣球品种“含羞叶”的不定芽诱导率和平均不定芽数分别为72.1％和5.1个；而大花绣球品种“无尽夏”的不定芽诱导率仅为10.4％，平均不定芽数为2.3个。表6结果表明已报道的叶片直接诱导不定芽培养基只适用于大花绣球的部分品种，而对大花绣球‘无尽夏’并不适用。

3、‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’3个大花绣球品种对本发明的平行试验

叶片愈伤诱导培养基：ms培养基中加入终浓度为3.0mg/l的细胞分裂素n-(2-氯-4-吡啶基)-n’-苯基脲cppu、终浓度为0.1mg/l的生长素吲哚丁酸iba、终浓度为30g/l的蔗糖，氢氧化钠或盐酸调整ph值至5.8，高压灭菌；

分别剪取步骤1中‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’无菌组培苗顶生第三至第六个叶片，采取垂直于主脉切割一刀并去叶柄和叶稍的切割方式接种于愈伤诱导培养基上，培养室温度为25±2℃，暗培养20天后进行光照培养(光照强度为1500lx，光照时间为12h/d)，40天后统计叶片愈伤诱导率并调查愈伤生长情况，结果如表7所示：

表7‘无尽夏’、‘含羞叶’和‘艾薇塔’3个大花绣球品种对本发明的平行试验

注：+一般；++较好；+++旺盛.

表7显示绣球品种‘艾薇塔’组培苗叶片的愈伤诱导率为75.3％，而绣球品种‘含羞叶’组培苗叶片的愈伤诱导率仅为15.4％。表7结果表明本发明的叶位、暗培养时间及叶片愈伤诱导培养基只适用于绣球品种‘无尽夏’，对绣球品种‘含羞叶’和‘艾薇塔’并不适用，进而证明本发明也不适宜其他同类产品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干修改和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。