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自然发酵酸鱼中微生物群落多样性与理化性质分析

花匠小妙招
2024-08-23 03:36

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071000；2.河北省海洋与水产科学研究院，河北秦皇岛 066600；3.河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛 066600；4.石家庄市水产技术推广站，河北石家庄 050000）

摘要：为探讨自然发酵酸鱼中微生物群落与理化性质的关系，对自然发酵酸鱼的主要理化性质进行测定，并采用高通量测序技术研究酸鱼中的微生物多样性，根据Spearman 相关系数探究优势微生物与理化指标的相关性。结果显示，自然发酵酸鱼的pH 值、总酸、氨基酸态氮、挥发性盐基氮和丙二醛的含量分别为4.28～4.38、3.37%～3.86%、0.62 g/100 g～0.69 g/100 g、30.51 mg/100 g～37.10 mg/100 g 和1.81 mg/kg ～2.72 mg/kg；检测出苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺5 种生物胺。微生物多样性结果显示乳杆菌属和梭菌属是主要的细菌属；哈萨克斯坦酵母属是主要的真菌属。相关性分析显示乳杆菌属、哈萨克斯坦酵母属与氨基酸态氮呈正相关，而与挥发性盐基氮、丙二醛、组胺和尸胺均呈负相关。该研究揭示乳杆菌属和哈萨克斯坦酵母属在酸鱼品质形成中发挥着重要作用，为进一步筛选功能性微生物用于酸鱼发酵提供理论基础。

2021 年中国渔业统计年鉴显示，2020 年河北省淡水鱼年产量约为23.13 万t，其中鲤鱼产量约占总产量的43.81%。但是，河北省淡水鱼加工产品仅为13 985 t，加工方式较为单一，多为冷冻，还有少量的腌制鱼类产品（仅2 808 t），加工利用率低[1]。因此，合理利用鲤鱼资源，研发新的淡水鱼加工方法，生产多样化的加工产品，为消费者提供更多选择，已成为河北省淡水鱼产业健康可持续发展的迫切需要。

酸鱼是贵州省黔东南侗族的传统发酵美食，湘西苗族也有制作习俗，食用方式多为煎炸或生食。传统酸鱼属于自然发酵，应用鲤鱼作为发酵原料，其中的微生物区系非常复杂，与原料和加工环境密切相关，并最终影响产品品质。在酸鱼发酵过程中，通过微生物对蛋白质、碳水化合物、脂肪等进行降解，形成了具有独特酸味口感、营养丰富的产品[2]。目前，关于黔东南和湘西的发酵酸鱼，已有大量研究报道，主要集中在微生物组成及其与风味或品质的关系、功能性菌株的筛选、发酵剂的制备、发酵工艺的优化和贮藏过程中的品质变化等方面。Liu 等[3]发现乳杆菌、四联球菌和魏斯氏菌是酸鱼中的主要优势菌。相关研究者系统地研究了植物乳杆菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌和酿酒酵母制成的不同混合发酵剂对低盐发酵酸鱼的影响，证实混合发酵剂接种发酵对酸鱼品质提高具有积极作用[4-7]。Zang 等[8]发现乳杆菌参与了最多的风味形成过程，主导酸鱼的发酵，并且葡萄球菌、肠球菌和假丝酵母对各种风味形成表现出积极影响。生物胺是生物体正常的组成部分，起到维持机体代谢和免疫稳定的作用，但过量摄入会导致人体出现头痛、恶心、呕吐等异常生理反应[9]。杨琴[9]发现pH 值对产胺菌株的产胺能力有显著影响，氨基酸脱羧酶具有菌株特异性。张大为等[10]通过单因素和响应面试验优化了发酵酸鱼的工艺条件，优化后酸鱼产生大量香气。孙颖瑛等[11]发现，在4 ℃冷藏条件下有效减缓了酸鱼中水分的流失和蛋白质的降解，并且较好地保留了外观、气味和口感。

然而，迄今为止，已有的酸鱼研究主要是针对黔东南和湘西产地的酸鱼，对其它地区自然环境下发酵的酸鱼研究较少。此外，已有的研究主要是针对细菌多样性开展研究，对真菌的研究较为罕见。通过引入传统发酵酸鱼工艺，了解微生物多样性及其与理化特征的相关性，对河北地区淡水鱼资源尤其是鲤鱼的加工利用非常重要，同时为能够定向筛选改进酸鱼品质的微生物作为发酵剂提供依据。因此，本研究拟以河北省保定地区自然发酵酸鱼为对象，首先测定pH 值、总酸（total acidity，TA）、氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AAN）、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和生物胺指标，评估该地自然环境下发酵酸鱼的理化特征。然后，利用高通量测序技术研究该地区酸鱼中微生物群落组成，并结合Spearman 相关系数，分析优势微生物对理化特征的影响，以期为河北地区引进酸鱼发酵工艺，以及进一步筛选功能微生物、制备酸鱼发酵剂和研发可控发酵工艺提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲤鱼（500 g/条～800 g/条，选用河北保定当地养殖的鲤鱼）、辅料（小米、食盐、辣椒、生姜、蔗糖、大蒜、大葱、料酒、花椒、桂皮、八角，均为本地品种）：市售；1，1，3，3-四乙氧基丙烷、生物胺标准品（色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺）、丹磺酰氯：上海源叶生物科技有限公司；乙腈、甲醇（均为色谱纯）：北京迈瑞达科技有限公司；E.Z.N.A. R soil DNA 试剂盒：Omega Biotek 公司；乙酸、硫代巴比妥酸、硼酸：国药集团化学试剂有限公司；乙二胺四乙酸二钠、乙酸钠、氧化镁、甲基红、溴甲酚绿、三氯乙酸：福晨（天津）化学试剂有限公司。以上化学试剂除说明外，其余均为分析纯。

1.2 仪器与设备

分光光度计（721-G）：上海仪电分析仪器有限公司；pH 计（PHS-3DW）：合肥桥斯仪器设备有限公司；可调高速匀浆机（FSH-2）：常州国华电器有限公司；高速冷冻离心机（TGL-16MC）：长沙湘锐离心机有限公司；液相色谱系统（Waters Arc 2489）：沃特森科技（上海）有限公司；色谱柱（WondaSilC18，4.6 mm×250 mm，5 μm）：岛津技迩（上海）商贸有限公司；基因扩增仪（TC-96）：杭州博日科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酸鱼制作备及样品预处理

根据张大为等[10]和覃启平[12]的方法制备酸鱼，并稍做修改。选择河北保定当地同一渔商的夏季鲤鱼，将新鲜的鲤鱼宰杀，清洗，剖开背部和腹部，剔除内脏，将鱼体内外均匀地抹一层食盐（鱼盐质量比为10∶1）。将小米蒸熟，摊开晾干，加盐（5%）拌匀。生姜洗净，切片，加5%食盐腌渍备用。辣椒洗净，切片，用20%的盐水浸泡12 h，备用。生姜和辣椒添加量为鱼质量的2%。根据鱼的质量，按照熟制小米55%，大蒜、大葱、蔗糖各2%，料酒1%，花椒、桂皮、八角各0.3%的比例拌匀，制成发酵辅料。将发酵辅料均匀地覆盖鱼体各处，然后将鱼闭合成原状。将发酵坛洗净抹干，各种原料入坛顺序为辣椒、姜片、鲤鱼、辣椒、姜片、鲤鱼，每罐中约放置10 条鲤鱼，装至坛体积95%，最上层撒适量熟制小米。将坛中物料夯实压紧，封口处用水封好。共设置4 个平行发酵罐，在室温环境（25 ℃）中发酵35 d。

发酵结束后，在各罐内选取不同位置的鲤鱼，除去鱼鳞、鱼刺，将鱼肉绞碎成肉糜，依次将4 个罐中所取样品编号为S1、S2、S3 和S4。样品于-80 ℃条件下储存备用。

1.3.2 品质分析

1.3.2.1 pH 值测定

根据Zang 等[13]的方法测定酸鱼的pH 值。将10 g 酸鱼与90 mL 蒸馏水混合，使用高速匀浆机，12 000 r/min匀浆1 min。每个样品使用pH 计重复测定3 次，结果取平均值。

1.3.2.2 总酸（TA）含量测定

根据GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》的方法测定总酸含量[14]。

1.3.2.3 氨基酸态氮（AAN）含量测定

根据GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》的方法测定AAN 含量[15]。

1.3.2.4 挥发性盐基氮（TVB-N）含量测定

根据GB 5009.228—2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》的方法测定TVB-N 含量[16]。

1.3.2.5 丙二醛（MDA）含量测定

根据GB 5009.181—2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》的方法测定MDA 含量[17]。

1.3.2.6 生物胺含量测定

根据高效液相色谱法测定酸鱼中的生物胺含量，液相色谱条件：流动相A 为乙腈，流动相B 为乙酸铵溶液（0.1 mol/L），流速为1 mL/min，柱温40°C，色谱柱为WondaSil C18，紫外检测器波长为254 nm，进样体积为20 μL，采用梯度洗脱程序[18]。

1.3.3 DNA 提取及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增

按照E.Z.N.A.R soil DNA 试剂盒使用说明，提取总DNA。使用通用引物338F（5＇-ACTCCTACGGAGGGCAGCAG-3＇）和806R（5＇-GGACTACHVGGGTWTCTA -AT-3＇）扩增细菌16S rRNA 的V3-V4 区域。用正向引物ITS1F（5＇-CTTGGTCATTAGGAGAAGTAA-3＇）和反向引物ITS2R（5＇-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3＇）扩增真菌的ITS1-ITS2 区域[13]。PCR 条件：95 ℃预变性3 min；细菌27 个循环，真菌35 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s）；72 ℃延伸10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 扩增产物。细菌PCR 反应体系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向引物（5 μmol/L）0.8 μL，反向引物（5 μmol/L）0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）0.2 μL，Template DNA 10 ng，最后用ddH2O 补充总体积至20 μL。真菌PCR 反应体系：10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正向引物（5 μmol/L）0.8 μL，反向引物（5 μmol/L）0.8 μL，rTaq Polymerase 0.2 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，最后用ddH2O补充总体积至20 μL。

1.3.4 Illumina MiSeq 测序及微生物多样性分析

根据测序平台标准程序构建PE 2×300 bp 库。鉴定文库后，在Illumina MiSeq 平台上分别对细菌和真菌序列进行测序。提取原始序列，使用Fastp（v.0.19.6）软件对原始序列进行质控；根据重叠关系，使用Flash（v.1.2.11）软件对pair-end 双端序列进行拼接。使用Uparse（v.7.0.1090）软件根据97%相似度的进行OTU聚类并去除嵌合体。使用RDP Classifier（v.2.11）软件注释序列。比对SILVA（v.130）数据库和UNITE（v.8.0）数据库，分别对细菌和真菌进行物种分类注释。Alpha 多样性的评估使用Mothur（v.1.30.2）软件。

1.4 统计分析

试验重复3 次，试验结果使用Origin 2018 和Excel 进行统计学分析，使用SPSS 23 进行显著性分析，使用Spearman 分析优势微生物与理化指标的相关性。

2 结果与分析

2.1 自然发酵酸鱼的一般品质特征

酸鱼样品的pH 值、总酸、氨基酸态氮、挥发性盐基氮和丙二醛的测定结果如表1 所示。

表1 自然发酵酸鱼品质特征
Table 1 Quality characteristics of naturally fermented Suanyu

注：同列不同字母表示具有显著性差异（P＜0.05）。

pH 值与TA 含量是酸味发酵产品的重要质量指标。由表1 可知，酸鱼样品的pH 值为4.28～4.38，该结果与Zeng 等[19]报道的南方地区的酸鱼结果类似。TA 含量为3.37%～3.86%，低于张大为等[10]用金鲳鱼制备的酸鱼中的TA 含量，这可能与原料本身的差异有关。AAN含量是评价鱼露、虾酱等发酵水产品成熟度的首要指标[20]。酸鱼样品的AAN 含量为0.62 g/100 g～0.69 g/100 g，高于王华娟[21]研究的自然发酵酸鱼。TVB-N 含量是评价水产品的新鲜度及腐败程度的重要指标[22]，其含量与某些特定的腐败菌和内源酶的活性有关[23]。自然发酵酸鱼的TVB-N 含量为30.51 mg/100 g～37.10 mg/100 g，超过了新鲜度标准（25 mg/100 g～30 mg/100 g），有两组样品超过国家限量标准（35 mg/100 g）[3]。Liu 等[3]测定自然发酵21 d 酸鱼中TVB-N 含量为30.11 mg/kg，而王华娟[21]在自然发酵50 d 的酸鱼中检测到的TVB-N 含量为52.35 mg/100 g。作为一种传统的发酵鱼类，自然发酵酸鱼中高TVB-N 含量的现象可能是由于过长的发酵时间导致的，因此筛选适合酸鱼发酵的微生物作为发酵剂进而快速完成酸鱼的酸化过程，缩短发酵时间，是酸鱼品质提升和工艺引入的关键。MDA 含量是肉类脂质氧化状态的生物标志物之一，肉类中多不饱和脂肪酸氧化会降低产品质量[24]。优质肉制品的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值最高限量为5 mg MDA/kg[25]。酸鱼样品的MDA 含量为1.81 mg/kg～2.72 mg/kg，脂肪氧化程度较低，与Gao 等[26]报道的接种发酵酸鱼中TBARS 结果类似，但高于Zang等[13]研究的发酵4 周的酸鱼。

2.2 自然发酵酸鱼的生物胺分析

生物胺主要由高氨基酸脱羧酶活性的微生物（如肠杆菌）产生[27]。本研究对酸鱼样品中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺含量进行了测定，结果如图1 所示。

图1 自然发酵酸鱼的生物胺含量
Fig.1 Biogenic amine content of naturally fermented Suanyu

如图1 所示，所有酸鱼样品均检出5 种生物胺：苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺，这与曾雪峰[25]研究的湖南传统酸鱼中主要生物胺种类一致，本研究中5 种胺含量分别为6.44 mg/kg ～10.43 mg/kg、77.68 mg/kg ～118.65 mg/kg、154.34 mg/kg～230.16 mg/kg、8.27 mg/kg～25.97 mg/kg 和39.90 mg/kg～58.26 mg/kg。腐胺和尸胺参与人体蛋白质合成；酪胺具有抗氧化作用，增加血糖浓度；组胺可参与局部免疫反应，行使神经递质功能[9]。在生物胺中，组胺毒性最强，酪胺次之，尸胺和腐胺的毒性最小，过量摄入会引起人体不适[9]。摄入过多的组胺和酪胺会引起食物中毒，美国食品药品监督管理局规定的鱼类产品中组胺和酪胺的限量标准分别为50 mg/kg[28]和100 mg/kg[29]，所有酸鱼样品的组胺和酪胺含量均在该限定范围内，但根据GB 10136—2015《食品安全国家标准动物性水产制品》标准规定组胺限量为20 mg/kg，本研究中4 组平行样本中S4 样本的组胺含量（25.97 mg/kg）超过限量标准。腐胺和尸胺在酸鱼样品中含量较高，有关研究表明，这两种多胺类可通过抑制组胺和酪胺代谢酶的作用，增加组胺和酪胺的蓄积，增强组胺的毒性，而且还会生成具有致癌作用的亚硝胺[9，30]。因此，将来有必要研究传统酸鱼中对腐胺和尸胺有积极抑制作用或者降解能力的功能微生物。

2.3 自然发酵酸鱼中细菌群落组成及其与品质的相关性分析

2.3.1 细菌测序的数据统计

酸鱼样品中细菌的测序信息如表2 所示。

表2 自然发酵酸鱼中细菌的高通量测序信息
Table 2 High-throughput sequencing information of bacteria in naturally fermented Suanyu

由表2 可知，序列经优化后，共得到154 022 条优化序列，S1 序列数最多，S4 序列数最少，所有样品平均序列数为38 505 条，平均长度为419 bp。所有样品中总碱基数为64731569。

2.3.2 细菌多样性评估

Chao 和Ace 指数反映物种群落丰富度，Shannon和Simpson 指数将物种的丰富度和均匀度综合考虑，代表物种群落的多样性，Coverage 指数代表抽样的完整性，数值越大物种覆盖率越好。结果如表3 所示。

表3 自然发酵酸鱼中细菌的Alpha 多样性分析
Table 3 Alpha diversity analysis of bacteria in naturally fermented Suanyu

样品编号Coverage指数S1 39.33 53.07 1.54 0.26 0.99 S2 29.00 29.48 1.10 0.40 0.99 S3 46.00 44.04 2.32 0.14 0.99 S4 82.32 83.63 2.26 0.15 0.99 Chao指数Ace指数Shannon指数Simpson指数

由表3 可知，S4 的丰富度指数最高，S2 最低，说明S4 样品的物种丰富度最高；Shannon 指数与多样性成正比，Simpson 指数与多样性成反比，结果表明S3 样品物种多样性最高。4 个样品的物种覆盖率均在99%以上，表明抽样结果的完整性足够高。

2.3.3 细菌群落的OTU 组成分析

根据97%的相似性对序列进行聚类，形成样品中的分类操作单元（operational taxonomic unit，OTU）并绘制Venn 图，结果如图2 所示。

图2 自然发酵酸鱼中细菌群落Venn 图
Fig.2 Venn diagram analysis of bacterial community in naturally fermented Suanyu

由图2 可知，根据OTU 数目，样品从高到低排序为S4，S3，S1，S2。所有样品中共有OTU 21 种，S4 样品中独有OTU 数最多，S1 样品最少。

2.3.4 细菌群落的相对丰度

所有酸鱼样品中共检测出11 个细菌门，16 个细菌纲，32 个细菌目，46 个细菌科，70 个细菌属。本研究分析了4 个样品中细菌在门和属水平上的物种组成情况，结果如图3 所示。

图3 酸鱼细菌群落在门和属水平上的相对丰度
Fig.3 Relative abundance of bacterial community in Suanyu at phylum and genus levels

如图3A 可知，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）是酸鱼样品中的高丰度菌门。这与Zang 等[13]研究的南方酸鱼中优势细菌门基本一致，在其他种类的发酵鱼中也获得了类似的结果[31-32]。所有样品中厚壁菌门丰度均为70%以上，是主要的优势菌门。在S3 和S4 样品中变形菌门丰度较高（S3＞2%，S4＞20%）。变形菌门在肠道中大量繁殖会影响人体肠道代谢稳定性和菌群结构[33]。因此，在发酵酸鱼时应严格控制变形菌门的大量繁殖。

由图3B 可知，在属水平上共检测出7 个优势细菌属（相对丰度＞5%），分别为乳杆菌属（Lactobacillus）、梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_7）、漫游球菌属（Vogococcus）、乳球菌属（Lactococcus）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、变形杆菌属（Proteus）、摩根氏菌属（Morganella）。其中，乳杆菌属、梭菌属和乳球菌属在所有样本中普遍存在，而漫游球菌属、消化链球菌属、变形杆菌属和摩根氏菌属主要存在于S3、S4 样本中。乳杆菌属为第一优势菌属，平均丰度为31%，这与林城杏[34]研究的贵州酸鱼中第一优势菌属相同。乳杆菌属在鱼茶[28，35]、酸菜[36]等其他发酵食品中也起到主导发酵的作用。其次是梭菌属，在S2 样本中丰度最高（50%），S4 样本中丰度最低（9%），平均丰度为28%，其丰度占比与乳杆菌属接近。目前酸鱼中的梭菌属尚未见报道，该菌相近属Clostridium_sensu_stricto_1 在白酒制曲阶段被认为是主要的优势菌属，能够分泌蛋白酶、淀粉酶等水解原料，为酿酒过程中的美拉德反应的进行提供大量原料[37]。乳球菌在所有样品中均有发现（S1 22%，S2 8%，S3 10%，S4 2%），在其他发酵鱼研究中也有乳球菌为优势菌属的相关报道[38]。此外，仅S3和S4 样品中发现了较高丰度的变形杆菌属和摩根氏菌属，这两种菌被认为与生物胺的生成有关[39]。

2.3.5 细菌菌属与酸鱼品质之间的相关性

分别通过Spearman 相关系数构建优势微生物与酸鱼的品质特性（pH 值、AAN 含量、TVB-N 含量、MDA 含量）和生物胺之间的关系。通过Heatmap 图可视化展示样品中不同物种与各指标之间的相关性，结果如图4 所示。

图4 细菌菌属与理化性质/生物胺的相关性分析
Fig.4 Correlation analysis between the bacterial genera and physicochemical properties/biogenic amine

***表示相关性高度显著，P≤0.001。

由图4A 可知，乳杆菌属与pH 值、TA 含量和AAN 含量呈正相关，与MDA 含量和TVB-N 含量呈负相关，说明乳杆菌属在发酵过程中能促进酸鱼酸化和成熟，并能抑制TVB-N 和MDA 含量的积累。梭菌属与TA 含量呈正相关，与其他指标呈负相关且相关性较弱。乳酸菌能够利用碳水化合物和蛋白质产生多种有机酸和游离氨基酸，赋予发酵食品独特的风味[34]。本研究中乳杆菌属和乳球菌属均与TA 含量和AAN 含量呈正相关，证实了乳酸菌在酸鱼发酵中的积极作用。

由图4B 可知，乳杆菌属与苯乙胺、腐胺和酪胺呈正相关，与尸胺和组胺呈负相关；梭菌属与苯乙胺相关性较弱，与其他生物胺呈负相关；乳球菌属与苯乙胺呈正相关，与其他胺类均呈负相关。

2.4 自然发酵酸鱼中真菌群落组成及其与品质的相关性分析

2.4.1 真菌测序的数据统计

酸鱼样品中真菌测序信息如表4 所示。

表4 自然发酵酸鱼中真菌的高通量测序信息
Table 4 High-throughput sequencing information of fungi in naturally fermented Suanyu

由表4 可知，共计得到195 108 条优化序列，S4 样品序列数最多，S2 样品序列数最少。所有样品平均序列数为48 777 条，平均长度为256 bp。所有样品中总碱基数为48 593 662。

2.4.2 真菌多样性评估

酸鱼中真菌的Alpha 多样性分析如表5 所示。

表5 自然发酵酸鱼中真菌的Alpha 多样性分析
Table 5 Alpha diversity analysis of fungi in naturally fermented Suanyu

样品编号Coverage指数S1 53.00 52.94 1.05 0.65 0.99 S2 62.00 62.41 1.37 0.55 0.99 S3 467.00 467.24 4.59 0.06 0.99 S4 22.00 22.00 1.74 0.36 0.99 Chao指数Ace指数Shannon指数Simpson指数

由表5 可知，S3 样品的丰富度最高，S4 最低；S3样品物种多样性最高，S1 最低。4 个样品的物种覆盖率均在99%以上，表明抽样结果的完整性足够高。

2.4.3 真菌群落的OTU 组成分析

根据97%的相似性对序列进行聚类，形成样品中的OTU 并绘制Venn 图，结果如图5 所示。

图5 自然发酵酸鱼中真菌群落Venn 图
Fig.5 Venn diagram analysis of fungal community in naturally fermented Suanyu

由图5 可知，S3 样品独有OTU 数最高，S4 样品最低，所有样品共有OTU 仅为7 种，每个样品独有OTU占该样品OTU 总数的近半数，说明自制酸鱼在发酵过程中每个样品中的真菌组成差异很大。

2.4.4 真菌群落的相对丰度

所有样品中共检测出6 个真菌门，15 个真菌纲，26 个真菌目，39 个真菌科，52 个真菌属。分别研究了4个样品中真菌在门和属水平上的物种组成情况，结果如图6 所示。

图6 酸鱼真菌群落在门和属水平上的相对丰度
Fig.6 Relative abundance of fungal community in Suanyu at phylum and genus levels

如图6A 可知，子囊菌门（Ascomycota）为所有样品的优势菌门，在S1 和S2 样品中丰度高达96.36%和91.35%。S3 和S4 样品的高丰度真菌门分别为unclassified_k_Fungi（68.33%）和担子菌门（Basidiomycota）（64.33%），而子囊菌门在S3 和S4 样品丰度相对较低，为29.97%和35.64%，丰度较低的原因可能是自然发酵过程中受到了杂菌污染，抑制了子囊菌门的生长。

如图6B 可知，优势真菌属（相对丰度＞5%）分别为哈萨克斯坦酵母属（Kazachstania）、unclasified_k_Fungi、壶菌属（Apiotrichum）、青霉属（Penicillium）、曲霉属（Aspergillus）、枝孢属（Cladosporium）、假丝酵母属（Candida）。哈萨克斯坦酵母属是S1 和S2 样品中的优势真菌属，丰度高达80.64%和73.85%，在S4 样品丰度较低，为4.4%。unclassified_k_Fungi 在S3 样品中达到最高丰度值68.33%，在其他样品中丰度在5%以下。壶菌属在S4 样品中具有最高丰度58.31%，其他样品中丰度均在3%以下。青霉属在S4 样品中丰度最高（9.2%），S2 样品最低（0.5%）。曲霉属在S1 样品中丰度最高（6.0%），枝孢属在S2 样品中丰度最高（5.3%），假丝酵母属在S4 样品中丰度最高（5.5%）。S3 和S4 样本在属水平上与其他样本差异的原因可能是在自然发酵过程中受到更多非子囊菌门的杂菌污染，产生了较高丰度的未分类真菌属和壶菌属。

2.4.5 真菌菌属与酸鱼品质之间的相关性

酸鱼样品中真菌和理化性质及生物胺相关性分析结果如图7 所示。

图7 真菌菌属与理化性质、生物胺的相关性分析
Fig.7 Correlation analysis between the fungal genera and physicochemical properties/biogenic amine

A.真菌菌属与理化性质的相关性分析；B.真菌菌属与生物胺含量的相关性分析；***表示相关性高度显著，P≤0.001。

如图7A 可知，哈萨克斯坦酵母属与pH 值、TVBN 含量、MDA 含量呈负相关，与TA 和ANN 呈正相关。unclasified_k_Fungi 是S3 样本中的优势菌属，与理化性质相关性不强。壶菌属是S4 样本中的优势菌属，与pH 值呈显著正相关。

如图7B 可知，哈萨克斯坦酵母属与苯乙胺含量呈正相关，与其他生物胺含量均呈负相关。S3 样本中unclasified_k_Fungi 与所有生物胺含量均呈负相关。S4 样本中壶菌属与腐胺、酪胺含量呈显著正相关，与其他生物胺含量呈正相关，这可能是S4 样本中总胺含量较高的原因之一。曲霉属与苯乙胺含量呈显著正相关。虽然本研究中多数真菌与生物胺含量呈正相关，但优势属与生物胺含量多呈负相关。哈萨克斯坦酵母属目前在湖南、贵州等地的传统酸鱼中尚未见报道，可以深入研究。

3 结论

对自然发酵酸鱼的理化性质进行了评价，AAN 含量丰富，酸鱼成熟度较好；MDA 含量符合优质肉制品限量标准；脂肪氧化程度低。TVB-N 含量和生物胺含量较高，一组样品中组胺含量超过了国家对腌制性水产品的限量标准，说明自然发酵酸鱼中存在组胺含量超标的风险。此外，多项研究也证实了在自然发酵酸鱼中存在高TVB-N 含量的现象。因此，研究河北省本地自然发酵酸鱼中的优势微生物及其与理化特征的相关性，有利于酸鱼品质改良和定向筛选优良菌株。在酸鱼发酵中，乳杆菌属、梭菌属是主要优势细菌属，哈萨克斯坦酵母属是主要优势真菌属。优势菌属中乳杆菌属和哈萨克斯坦酵母属与TVB-N 含量和MDA含量均呈负相关，与ANN 含量呈正相关；乳杆菌属与尸胺和组胺呈负相关，梭菌属、哈萨克斯坦酵母属与腐胺、尸胺、组胺和酪胺均呈负相关。乳杆菌属和哈萨克酵母属在主导发酵的同时对快速降低pH 值，减少TVB-N 含量、MDA 含量和生物胺产生方面有积极作用，在未来对河北酸鱼的研发生产中应重点关注。本研究为进一步筛选适用于酸鱼发酵的功能微生物和靶向改善酸鱼品质提供了一定理论依据，对河北地区引入酸鱼生产具有重要意义。

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