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一种防治细菌性病害的制剂及其应用

花匠小妙招
2024-11-14 15:22

一种防治细菌性病害的制剂及其应用

1.本发明属于病害防治技术领域，具体涉及一种防治细菌性病害的制剂及其应用。

背景技术：

2.西瓜食酸菌是细菌性果斑病(bacterial fruit blotch，bfb)的病原，该病害在高温高湿环境下侵染葫芦科植物，在甜瓜、黄瓜、西瓜等瓜菜上发生，导致植株产生病斑、萎蔫或果实腐烂等。在世界经济一体化的大背景下，该病害已通过全球贸易活动在很多个国家传播，如美国、澳大利亚、巴西、日本、马利亚纳群岛、印度尼西亚、土耳其等国家传播，尤其在甜瓜产地成为了生产上难以控制的病害。目前，用于防治此病害的次氯酸钠、46％氢氧化铜、72％农用硫酸链霉素等，长期使用这些农药导致植物产生抗药性，防治效果降低，农药的施用量持续增加，带来了农产品的药剂残留，以及环境严重污染，并且一定浓度的铜离子会使西瓜食酸菌进入有活力但不可培养状态(viable but nonculturable state，vbnc)，同时bfb的病菌群体中存在亚群ⅰ菌株多数对铜离子不敏感，含铜化学农药或杀菌剂能暂时有效防治bfb，但长期使用，会造成西瓜食酸菌对铜离子不敏感，有演变成抗铜细菌的巨大风险。

技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种防治细菌性病害的制剂及其应用。利用本发明所述防治细菌性病害的物质能够有效防治细菌性病害，并且不会使病原菌产生抗性，而且具有无污染的优势。
4.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
5.本发明提供了一种防治细菌性病害的制剂，有效成分包括实葶葱花序提取物。
6.优选的，所述制剂还包括农用药剂；所述农用药剂包括氢氧化铜溶液。
7.优选的，当所述制剂包括农用药剂时，所述实葶葱花序提取物和农用药剂的体积相等。
8.优选的，所述实葶葱花序提取物的制备包括以下步骤：
9.将实葶葱花序与提取剂混合浸提，得实葶葱花序提取物。
10.优选的，所述混合时，实葶葱花序和提取剂的质量体积比1.5g:10ml；所述提取剂包括极性提取剂。
11.优选的，所述极性提取剂包括水、甲醇和丙酮中的一种或几种；当所述极性提取剂为水时，所述浸提的时间为12～84h；在浸提过程中，每12～36h搅拌1～3次；
12.当所述极性提取剂为甲醇或丙酮时，所述浸提的时间为36～108h；在浸提过程中，每12～36h搅拌1～3次。
13.优选的，当所述极性提取剂为水时，所述浸提后，还包括离心；
14.当所述极性提取剂为甲醇或丙酮时，所述浸提后还包括抽滤和浓缩。
15.本发明提供了上述技术方案所述制剂在防治细菌性病害和/或提高植物抗病性中
的应用。
16.本发明提供了一种防治细菌性病害和/或提高植物抗病性的方法，包括以下步骤：
17.将上述技术方案所述制剂喷施于植物叶片。
18.优选的，所述喷施的次数为2次，每次喷施所述制剂时，所述制剂的用量优选为7～20ml/45株植物。
19.有益效果：
20.本发明提供了一种防治细菌性病害的制剂，有效成分包括实葶葱花序提取物。本发明防治细菌性病害的制剂为含有实葶葱花序的提取物，对细菌性病害的病原菌的增殖生长存在抑制作用，尤其是西瓜食酸菌，同时具有不易使病原菌产生抗性，无污染的优势。
21.而且本发明所述实葶葱花序提取物是从植物中提取得到的活性成分，属于植物源杀菌物质，具有比化学农药更环保、高效、低毒或无毒、易降解、选择性高、不产生抗药性等优点，因此，本发明所述实葶葱花序提取物的应用能够减少化学农药的施用，降低化学农药对人体与动植物的潜在危害，增强植物的抗病性，可提高作物产量和品质，是促进生态环境良性循环的有效方法，为生产上研发植物源杀菌剂抑制西瓜食酸菌提供了技术指导，为开发新型植物源抑菌剂或杀菌剂打开新思路，为开发和利用野生资源提供新途径，绿水青山，就是金山银山，促进生态环境可持续循环发展。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
23.图1为实葶葱花序图。
具体实施方式
24.本发明提供了一种防治细菌性病害的制剂，有效成分包括实葶葱花序提取物。在本发明中，所述细菌性病害优选包括甜瓜细菌性果斑病；所述细菌性病害的病原菌优选包括西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)。本发明所述实葶葱花序提取物可以长期使用，不会对环境造成污染，具有环保的优势。在本发明中，所述实葶葱花序可以包括花序轴及其着生在花序轴上的花，也可以为着生在花序轴上的花；若仅采用着生在花序轴上的花时，会存在费工费时的问题。
25.在本发明中，所述制剂优选还包括农用药剂；所述农用药剂优选包括氢氧化铜溶液；所述氢氧化铜溶液中氢氧化铜的质量百分含量优选为46％。在本发明中，当所述制剂包括农用药剂时，所述实葶葱花序提取物和农用药剂的体积优选相等，即防治细菌性病害的物质和农用药剂的体积比优选为1:1。当所述制剂包括农用药剂氢氧化铜时，不建议长期使用，一般情况下不建议使用超过3年，避免对环境造成污染，同时也能避免增加细菌抗铜风险。本发明提供的制剂只有实葶葱花序提取物时，可以长期使用，无污染。
26.本发明提供的制剂为植物源杀菌剂具有不易产生抗药性、防治效果明显且对环境相对安全等特点。本发明通过试验验证结果表明：本发明所述制剂的抑菌效果显著高于农业常用防治制剂次氯酸钠和氢氧化铜，还能在植株发病时期能够抑制病原菌的生长，降低发病率，提高植物抗病性。
27.在本发明中，所述实葶葱花序提取物的制备方法包括以下步骤：将实葶葱花序与提取剂混合浸提，得实葶葱花序提取物。在本发明中，所述混合时，实葶葱花序和提取剂的质量体积比优选为1.5g:10ml；即料液比为1.5:10；在本发明中，所述实葶葱花序和提取剂的质量体积比可以等比例扩大，即实葶葱花序和提取剂的质量体积比可以为3g：20ml，也可以为4.5g：30ml，以此类推。在本发明中，所述实葶葱花序优选为实葶葱盛花期时的花序，更优选为干燥的实葶葱盛花期时的花序，具体如图1所示；本发明对所述干燥的方式没有任何限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可；所述干燥结束的标准优选为将实葶葱盛花期时的花序干燥至恒重。在本发明中，所述实葶葱花序优选采自新疆农业大学野生植物资源圃；所述新疆农业大学野生植物资源圃的经纬度优选为43
°
54
′
n、87
°
20
′
e，海拔优选为831m。本发明所述实葶葱(allium galanthum)是野生种，又名雪花葱，因花葶实心而得名，中国境内仅野生分布于新疆的阿尔泰、布尔津、塔城和玛纳斯等地。在明确的料液比下，可清楚知道浸提液的制备所需实葶葱花序的质量，提取剂的体积，最终所得浸提液的浓度范围，为试验提供合理的范围值。试验中实葶葱花序采集于盛花期，花序中小花数量达最大值，小花开花数是150～400朵，小花开花数占整个花序的90％。盛花期实葶葱生长旺盛，采集此时期的花序(花)更能全面体现实葶葱的抑菌能力。
28.在本发明中，所述提取剂优选包括极性提取剂，进一步优选包括水、甲醇和丙酮中的一种或几种，更优选为水、甲醇或丙酮。在本发明中，所述水优选为无菌水。
29.在本发明中，当所述极性提取剂为水时，所述浸提的时间优选为12～84h，进一步优选为24～72h，更优选为36～64h，最优选为48h，采用本发明所述浸提时间能够避免因浸提时间过短或过长引起的活性物质提取不完全或提取剂挥发大的情况的出现；所述浸提的温度优选为室温，即20～25℃；所述浸提优选在避光阴凉环境中进行，能够避免见光分解导致有效物质的损失。在本发明中，在浸提过程中，每12h～36h优选搅拌1～3次，更优选为每12h搅拌1次，使实葶葱花序与提取剂得到充分接触，以便充分浸提出活性物质(抑菌物质)；而且采用本发明设定的搅拌次数不会造成提取剂过于挥发。本发明对所述搅拌的方式没有任何要求，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明中，所述浸提后，优选还包括离心，离心所得上清液即为防治细菌性病害的物质；所述离心的转速优选为3000rpm；所述离心的时间优选为10min。本发明利用水作为提取剂能够把植物样品中的水溶性化学物质提取出来，又对供试的病原菌没有抑制作用，添加上离心后，能够去除水提取物中的杂质，避免了由于杂质多容易污染情况的出现。
30.在本发明中，当所述极性提取剂为甲醇或丙酮时，所述浸提的时间优选为36～108h，进一步优选为48～84h，更优选为52～80h，最优选为72h，采用本发明所述浸提时间能够避免因浸提时间过短或过长引起的活性物质提取不完全或提取剂挥发大的情况的出现；所述浸提的温度优选为室温，即20～25℃；所述浸提优选在避光阴凉环境中进行，能够避免见光分解导致有效物质的损失。在本发明中，在浸提过程中，每12～36h优选搅拌1～3次，更优选为每12h搅拌1次，使实葶葱花序与提取剂得到充分接触，以便充分浸提出活性物质(抑菌物质)；而且采用本发明设定的搅拌次数不会造成提取剂过于挥发。本发明对所述搅拌的方式没有任何要求，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。在本发明中，所述浸提后，优选还包括对浸提所得上清液进行抽滤和浓缩。在本发明中，所述抽滤的方式优选为过滤纸抽滤；所述过滤纸的孔径优选为0.22μm。在本发明中，所述浓缩优选在旋转蒸发仪进行；所
述浓缩的温度优选为60～70℃，进一步优选为62～68℃，更优选为64～66℃；所述浓缩的时间优选为45min。本发明所述提取剂中甲醇极性较强，能够提取出植物样品中的大部分物质；丙酮极性适中，对极性和非极性成分均能较完全地提取出来，还具有挥发性强、沸点低的特点，使得操作上非常简便。
31.在本发明中，当所述极性提取剂为水时，所述制剂中实葶葱花序提取物的浓度优选为50～150mg/ml，更优选为50mg/ml。本发明所述制剂对活菌数为108cfu/ml的西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株具有显著的抑制作用。当所述极性提取剂为甲醇时，所述制剂中实葶葱花序提取物的浓度优选为50～150mg/ml，更优选为100～150mg/ml，最优选为150mg/ml。本发明所述制剂对活菌数优选为107～109cfu/ml的西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株具有显著的抑制作用，进一步优选为107cfu/ml或109cfu/ml。当所述极性提取剂为丙酮时；所述制剂中实葶葱花序提取物的浓度优选为50～150mg/ml，更优选为150mg/ml。本发明所述制剂对活菌数优选为107～109cfu/ml的西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株具有显著的抑制作用，进一步优选为109cfu/ml。本发明在具体实施中，优选将以水为提取剂得到的浓度为50mg/ml的制剂，以甲醇为提取剂得到的浓度为150mg/ml的制剂和以丙酮为提取剂得到的浓度为150mg/ml的制剂按照1:1:1的体积比混合，得到混合制剂；所述混合制剂对活菌数优选为107～109cfu/ml的西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株具有显著的抑制作用。
32.本发明提供了实葶葱花序提取物或含有实葶葱花序提取物的上述技术方案所述制剂在防治细菌性病害和/或提高植物抗病性中的应用。在本发明中，所述细菌性病害优选包括甜瓜细菌性果斑病；所述细菌性病害的病原菌优选包括西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)。
33.本发明提供了一种防治细菌性病害和/或提高植物抗病性的方法，包括以下步骤：
34.将上述技术方案所述制剂喷施于植物叶片。
35.在本发明中，所述喷施的次数优选为2次，其中第1次喷施能够使制剂达到初步防治的效果，第2次喷施能够增强制剂防治效果。本发明每次喷施所述制剂时，所述制剂的用量优选为7～20ml/45株植物。本发明优选将所述制剂平均喷施到每株植物上。本发明所述植物优选瓜类植物；所述瓜类植物包括甜瓜。在本发明中，所述甜瓜的种植密度优选为700～900株/亩，更优选为800株/亩。
36.本发明所述方法，当采用进含有实葶葱花序提取物作为制剂时，可以长期使用，不会对环境造成污染，具有环保的优势。当所述制剂包括农用药剂时，可以短期使用，以免出现长时间使用含有农用药剂的制剂对环境造成污染造成以及增加细菌抗铜能力。
37.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种防治细菌性病害的制剂及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
38.实施例1
39.防治细菌性病害的物质(实葶葱花序水浸提液)的制备：
40.按料液比为1.5:10(m:v)取干燥至恒重的实葶葱盛花期时的花序(15g，简称实葶葱花序)与无菌水(100ml)，将干燥至恒重的实葶葱花序与无菌水混匀，室温下置于避光阴凉处浸提48h，每隔12h搅拌1次；将搅拌所得物质，在3000r/min下离心10min，收集上清液，得防治细菌性病害的制剂(质量浓度为150mg/ml实葶葱花序无菌水浸提液)；
41.用无菌水将防治细菌性病害的制剂稀释成质量浓度最终分别为50mg/ml、100mg/
ml和150mg/ml的制剂，依次记为制剂1、制剂2和制剂3。
42.实施例2
43.防治细菌性病害的物质(实葶葱花序甲醇浸提液)的制备：
44.按料液比为1.5:10(m:v)取干燥至恒重的实葶葱盛花期时的花序粉末(15g，简称实葶葱花序粉末)与甲醇(100ml)，其中实葶葱花序粉末的粒径在在0.01～0.45mm之间，将干燥至恒重的实葶葱花序与甲醇混匀，室温下置于避光阴凉处浸提72h，每隔12h搅拌1次，收集上清液用0.22μm过滤纸抽滤后用旋转蒸发仪浓缩(60～70℃，45min)，得防治细菌性病害的制剂(质量浓度为150mg/ml实葶葱花序甲醇浸提液，即1ml提取液相当于150mg植物粉末(干重)；
45.用无菌水将防治细菌性病害的制剂稀释成质量浓度最终分别为50mg/ml、100mg/ml和150mg/ml的制剂，依次记为制剂4、制剂5和制剂6。
46.实施例3
47.防治细菌性病害的物质(实葶葱花序丙酮浸提液)的制备：
48.按料液比为1.5:10(m:v)取干燥至恒重的实葶葱花序实葶葱盛花期时的花序粉末(15g，简称实葶葱花序粉末)与丙酮(100ml)，将干燥至恒重的实葶葱花序与丙酮混匀，室温下置于避光阴凉处浸提72h，每隔12h搅拌1次，收集上清液用0.22μm过滤纸抽滤后用旋转蒸发仪浓缩(60～70℃，45min)，得防治细菌性病害的制剂(质量浓度为150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液，即1ml提取液相当于150mg植物粉末(干重))；
49.用无菌水将防治细菌性病害的制剂稀释成质量浓度最终分别为50mg/ml、100mg/ml和150mg/ml的制剂，依次记为制剂7、制剂8和制剂9。
50.实施例4
51.实施例1制备得到的制剂1～3对西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)亚群i野生型fc440菌株(刘君.西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)tn5转座子插入突变体的制备和致病性缺失突变体的鉴定与分析[d].西北农林科技大学,2012)的抑制作用
[0052]
试验方法：
[0053]
制备kmb培养基：8g蛋白胨，0.6g k2po4·
3h2o，0.6g mgso4·
7h2o，6g琼脂，8ml体积百分含量为50％甘油，10m naoh 80μl，溶解后定容至400m l，分装在锥形瓶，121℃，高压蒸汽灭菌30min。
[0054]
制备nb液体培养基：1.2g牛肉膏，2g蛋白胨，10m naoh 160μl，定容到400ml，分装在锥形瓶，121℃，高压蒸汽灭菌30min。
[0055]
(1)采用抑菌圈法，以无菌水为空白对照，同时，以体积百分含量为1％次氯酸钠溶液和46wt.％氢氧化铜溶液为药剂对照。
[0056]
(2)制备菌悬液：在无菌条件下挑取西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株的单菌落于nb液体培养基中，按每10ml培养基加入3μl的氨苄青霉素，在28℃、220r/min条件下震荡培养800min；培养结束后，3000r/min下离心10min，离心后倒去上清液。在分光光度计600nm下比色(od值为0.5)，得菌悬液(活菌数为109cfu/ml/ml)，备用接种。
[0057]
(3)确定实验用菌悬液体积和浓度以及实施例1～实施例3中各花序浸提液体积：分别设置菌悬液1000μl、500μl、100μl和50μl的不同体积，若菌悬液体积过大，在kmb培养基表面形成的菌落过多；体积过小，形成单个菌落，用100μl时单个菌落刚好能在kmb培养基表
面连接形成完整大菌落的体积，因此确定了菌悬液体积为100μl用无菌水将菌悬液(od值为0.5)调至109cfu/ml、108cfu/ml、107cfu/ml梯度；在菌悬液浓度为109cfu/ml下，在不同菌悬液体积中分别加入花序浸提液30μl和15μl，将15μl浸提液滴在6mm滤纸圆片上，浸提液刚好附着在滤纸圆片上，不滑落，因此，确定了花序浸提液体积为15μl。
[0058]
(4)灭菌的kmb培养基冷却到45℃左右，按每10ml kmb加入3μl氨苄青霉素，倒平板冷凝后，分别加入100μl浓度为109cfu/ml、108cfu/ml或107cfu/ml的菌悬液涂布，静置凝成带菌平板，放入灭菌后的6mm滤纸圆片(3片/板)，将制剂1～3分别用0.22μm滤器过滤除菌，分别滴15μl在滤纸圆片上，倒置在人工培养箱中：温度28
±
2℃，黑暗条件下培养，依次记为处理1组、处理2组和处理3组，48h后观察有无抑菌圈，用十字交叉法测量各抑菌圈的直径。各菌悬液浓度每处理3个重复，抑菌率的计算公式为：抑制率＝(处理组抑菌圈的直径-对照组抑菌圈的直径)/对照组抑菌圈的直径
×
100％。
[0059]
(5)1％次氯酸钠、46％氢氧化铜的添加试验同步骤(4)。
[0060]
表1实施例1制备得到的制剂对西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株的抑制作用
[0061][0062]
注：抑制率＝(处理组抑菌圈的直径-对照组抑菌圈的直径)/对照组抑菌圈的直径
×
100％；抑制率呈负值表示在此浓度下对西瓜食酸菌呈促进作用，无抑制作用。
[0063]
由表1记载的可知，在109cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径呈显著性差异，1％次氯酸钠平均抑菌圈直径最大为1.44mm；在108cfu/ml下，制剂1(50mg/ml实葶葱花序水浸提液)平均抑菌圈最大为1.91mm；在107cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径无显著性差异，制剂2(100mg/ml实葶葱花序水浸提液)平均抑菌圈最大为1.24mm。1％次氯酸钠抑制率达56.52％，制剂1(50mg/ml实葶葱花序水浸提液)抑制率达75.23％。制剂1(50mg/ml实葶葱花序水浸提液)比1％次氯酸钠、46％氢氧化铜对西瓜食酸菌有较强抑制作用。按常规思路，制剂的浓度越高，对病原菌抑制率越大，本发明水浸提液(制剂1、制剂2、制剂3)在试验中没有遵循常规思路，说明水可以提取实葶葱的部分抑菌物质，只有在使用浓度为108cfu/ml下才能达到明显抑菌作用抑菌物质效果不如甲醇和丙酮。
[0064]
实施例5
[0065]
实施例2制备得到的制剂4～6对西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)亚群i野生型fc440菌株的抑制作用
[0066]
试验方法；步骤(1)至(3)如实施例5中所述。
[0067]
(4)灭菌的kmb培养基冷却到45℃左右，按每10ml kmb加入3μl氨苄青霉素，倒平板冷凝后，分别加入100μl浓度为109cfu/ml、108cfu/ml或107cfu/ml的菌悬液涂布，静置凝成带菌平板，放入灭菌后的6mm滤纸圆片(3片/板)，将制剂4～6用0.22μm滤器过滤除菌，滴15μl在滤纸圆片上，倒置在人工培养箱中：温度28
±
2℃，黑暗条件下培养，依次记为处理4组、处理5组和处理6组，48h后观察有无抑菌圈，用十字交叉法测量各抑菌圈的直径。各菌悬液浓度每处理3个重复。
[0068]
(5)1％次氯酸钠、46％氢氧化铜的添加试验同步骤(4)。
[0069]
表2实施例2制备得到的制剂对西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株的抑制作用
[0070][0071][0072]
注：抑制率＝(处理组抑菌圈的直径-对照组抑菌圈的直径)/对照组抑菌圈的直径
×
100％；抑制率呈负值表示在此浓度下对西瓜食酸菌呈促进作用，无抑制作用。
[0073]
由表2记载的可知，在109cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂6(150mg/ml实葶葱花序甲醇浸提液)平均抑菌圈直径最大为6.02mm；在108cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂6(150mg/ml实葶葱花序甲醇浸提液)平均抑菌圈最大为5.75mm；在107cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂6(150mg/ml实葶葱花序甲醇浸提液)平均抑菌圈最大为4.00mm，制剂6(150mg/ml实葶葱花序甲醇浸提液)抑制率最高达554.25％，实葶葱花序甲醇浸提液浓度越高，抑制作用越强，比1％次氯酸钠、46％氢氧化铜对西瓜食酸菌的抑制作用强。按常规思路，制剂的浓度越高，对病原菌抑制率越大，甲醇浸提液(制剂4、制剂5、制剂6)，说明甲醇可以有效提取实葶葱的抑菌物质，具有显著抑菌效果。
[0074]
实施例6
[0075]
实施例3制备得到的制剂7～9对西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)亚群i野生型fc440菌株的抑制作用
[0076]
试验方法；步骤(1)至(3)如实施例5中所述。
[0077]
(4)灭菌的kmb培养基冷却到45℃左右，按每10ml kmb加入3μl氨苄青霉素，倒平板冷凝后，分别加入100μl浓度为109cfu/ml、108cfu/ml或107cfu/ml的菌悬液涂布，静置凝成带菌平板，放入灭菌后的6mm滤纸圆片(3片/板)，将制剂7～9用0.22μm滤器过滤除菌，滴15μ
l在滤纸圆片上，倒置在人工培养箱中：温度28
±
2℃，黑暗条件下培养，依次记为处理7组、处理8组和处理9组，48h后观察有无抑菌圈，用十字交叉法测量各抑菌圈的直径。各菌悬液浓度每处理3个重复。
[0078]
(5)1％次氯酸钠、46％氢氧化铜的添加试验同步骤(4)。
[0079]
表3实施例3制备得到的制剂对西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株的抑制作用
[0080][0081][0082]
注：抑制率＝(处理组抑菌圈的直径-对照组抑菌圈的直径)/对照组抑菌圈的直径
×
100％；抑制率呈负值表示在此浓度下对西瓜食酸菌呈促进作用，无抑制作用。
[0083]
由表3记载的可知，在109cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂9(150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液)平均抑菌圈直径最大为6.42mm；在108cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂9(150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液)平均抑菌圈最大为4.86mm；在107cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂9(150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液)平均抑菌圈最大为1.81mm。制剂9(150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液)抑制率高达597.83％。制剂9(150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液)抑制作用最强，比1％次氯酸钠、46％氢氧化铜对西瓜食酸菌的抑制作用都强。按常规思路，制剂的浓度越高，对病原菌抑制率越大，丙酮浸提液(制剂7、制剂8、制剂9)在试验中遵循常规思路，说明丙酮可以有效提取实葶葱的抑菌物质，具有显著抑菌效果。
[0084]
实施例7
[0085]
实施例1～3制备得到的制剂1、制剂6、制剂9按体积比(1:1:1)混合后为制剂10对西瓜食酸菌(acidovorax citrulli)fc440野生型菌株的抑制作用试验方法；步骤(1)至(3)如实施例5中所述。
[0086]
(4)灭菌的kmb培养基冷却到45℃左右，按每10ml kmb加入3μl氨苄青霉素，倒平板冷凝后，分别加入100μl浓度为109cfu/ml、108cfu/ml或107cfu/ml的菌悬液涂布，静置凝成带菌平板，放入灭菌后的6mm滤纸圆片(3片/板)，将制剂10用0.22μm滤器过滤除菌，滴15μl在滤纸圆片上，倒置在人工培养箱中：温度28
±
2℃，黑暗条件下培养，依次记为处理10组，48h后观察有无抑菌圈，用十字交叉法测量各抑菌圈的直径。各菌悬液浓度每处理3个重复。
[0087]
(5)1％次氯酸钠、46％氢氧化铜的添加试验同步骤(4)。
[0088]
表4实施例8制备得到的制剂对西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株的抑制作用
[0089][0090]
由表4记载的可知，在109cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂10平均抑菌圈直径最大为6.96mm；在108cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂10平均抑菌圈最大为5.32mm；在107cfu/ml下，各处理平均抑菌圈直径有显著性差异，制剂10平均抑菌圈最大为2.25mm。制剂10抑制率达656.32％。制剂10抑制作用最强，比1％次氯酸钠、46％氢氧化铜对西瓜食酸菌的抑制作用都强。本发明制剂1、制剂6、制剂9按体积比1:1:1(即以水为提取剂得到的浓度为50mg/ml的制剂，以甲醇为提取剂得到的浓度为150mg/ml的制剂和以丙酮为提取剂得到的浓度为150mg/ml按体积比1:1:1)混合后能够有效抑制西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株。
[0091]
实施例8
[0092]
实施例1～实施例3制备得到的防治细菌性病害的物质的最小抑菌浓度(mic值)和最低杀菌浓度(mbc值)的测定
[0093]
实施例1制备得到的防治细菌性病害的物质的最小抑菌浓度(mic值)：
[0094]
试验方法：(1)取9支无菌试管，编号为1～9，于1号管中加入2ml无菌防治细菌性病害的制剂(将制剂用0.22μm滤器过滤除菌，得无菌防治细菌性病害的制剂)，在2～6管中先加入无菌水2ml，然后在第2支试管中加入无菌母液浸提液2ml，混匀后再取出2ml混合液放入第3支试管中，混匀后取出2ml加入第4支试管中，以此类推，直到第6支试管混匀后弃掉2ml，使得稀释后各试管中的浸提液浓度倍比降低，第7支试管加入2ml体积百分含量为1％次氯酸钠，第8支试管加入2ml 46wt.％氢氧化铜溶液，第9支试管为2ml无菌水为对照；
[0095]
(2)分别向上述的试管中加入2ml实施例1制剂3混匀，并重复3次，37℃培养24h后观察生长情况，将透明的最低药液浓度定为mic值。
[0096]
(3)由于菌悬液与无菌防治细菌性病害的物质等量混合，相当于将无菌防治细菌性病害的物质二倍稀释，最终待测无菌防治细菌性病害的物质为6个浓度梯度，分别为150、75、37.5、17.5、8.75、4.375mg/ml。
[0097]
(4)结果观察：通过肉眼比对发现试管内液体澄清透明经震荡后仍无沉淀产生，则此试管对应的浸提液浓度即为此浸提液对待测病菌的mic值。
[0098]
(5)将最低抑菌浓度以上的各浓度培养物分别取0.1ml加到kmb培养基上，用涂布棒将菌液涂匀，28℃培养24h后观察生长情况，重复3次。将无菌生长的最低浸提液浓度定为最mbc值。
[0099]
实施例2中制剂6和实施例3中制剂9制备得到的防治细菌性病害的物质的最小抑菌浓度(mic值)和最低杀菌浓度(mbc值)的试验方法同上。
[0100]
试验结果表明：实施例1制备得到的防治细菌性病害的物质对西瓜食酸菌的mic值为37.5mg/ml，对西瓜食酸菌的mbc范围在75～150mg/ml，实施例2制备得到的防治细菌性病害的物质对西瓜食酸菌的mic值为17.5mg/ml，对西瓜食酸菌的mbc范围在75～150mg/ml，实施例3制备得到的防治细菌性病害的物质对西瓜食酸菌的mic值为8.75mg/ml，对西瓜食酸菌的mbc范围在37.5～150mg/ml，均表现出一定抑菌和杀菌特性。
[0101]
实施例9
[0102]
实施例1～实施例3制备得到的防治细菌性病害的物质的半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect，ec
50
)
[0103]
试验方法：将实施例1制备得到的防治细菌性病害的物质二倍稀释，最终待测浸提液为6个浓度梯度，分别为150、75、37.5、17.5、8.75、4.375mg/ml，分别加入2ml实施例4制备得到的菌悬液(活菌数为109cfu/ml)。
[0104]
通过实施例8中步骤(5)观察其抑菌率。
[0105]
实施例2～实施例3制备得到的防治细菌性病害的物质的半最大效应浓度的试验方法同上。
[0106]
将抑菌率转换为概率值(y)，防治细菌性病害的物质的浓度转换成对数值(x)，利用spss 26.0中probit程序做回归分析，通过计算得出毒力回归方程(y＝a+bx)、半最大效应浓度(concentration for 50％of maximal effect，ec
50
)、95％置性限度以及相关系数，结果见表5。
[0107]
表5实施例1～实施例3制备得到的防治细菌性病害的物质对西瓜食酸菌亚群i野生型fc440菌株的毒力作用
[0108]
处理毒力方程ec
50
/(mg/ml)95％置信限度相关系数(r2)实施例1y＝-2.95+1.79x44.6938.31-52.750.98实施例2y＝-2.73+2.18x17.948.96-34.490.92实施例3y＝-2.67+2.72x9.66.00-13.990.98
[0109]
由表5记载的可知，实葶葱花序水浸提液的ec
50
为44.69mg/ml，实葶葱花序甲醇浸提液的ec
50
为17.94mg/ml，实葶葱花序丙酮浸提液的ec
50
为9.60mg/ml。
[0110]
实施例10
[0111]
制剂对带菌幼苗的防治效果
[0112]
试验方法：
[0113]
(1)供试的甜瓜种子先在30℃恒温培养箱中干燥12h，再在65℃的干热条件(电热恒温箱)下处理48h进行干热灭菌后备用。
[0114]
(2)育苗基质用草炭、蛭石和珍珠岩以3:1:1(体积比)的比例混合配制，播种于穴盘(高锰酸钾浸泡10min后清洗干净后的)，高温高湿(温度25～35(
±
1)℃，空气相对湿度≥45％)条件培养，出苗后每天傍晚浇水。
[0115]
(3)以无菌水为对照(ck)，设置4个处理，处理1(t1)为1％次氯酸钠，处理2(t2)为46wt％氢氧化铜溶液，处理3(t3)为实施例3制备得到的制剂9，处理4(t4)为实施例3制备得到的制剂9和46wt％氢氧化铜溶液的混合液(实施例3制备得到的制剂9和46wt％氢氧化铜溶液的混合体积比为1:1)，共5组，每组设置3组重复，每个重复15株。
[0116]
(4)当甜瓜幼苗生长至1片真叶时，采用喷雾接种法将109cfu/ml菌悬液接种，叶正
反面有小液滴但不滴落即可，共接菌1次，在接菌2d后对带菌幼苗分别喷施处理1～处理5的药剂，第一次喷施后隔2d后再次分别喷施处理1～处理5的药剂，共喷施2次，每次的喷施量为20ml/45株。
[0117]
(5)在喷施处理7d后调查统计幼苗的病情。
[0118]
(6)病情级数调查采用病情级数调查根据hopkins分级标准。叶片发病分级标准如下，0级：无病斑；1级：叶片病斑面积占整片叶面积10％及以下；2级：病斑较多，病斑面积占整叶面积的10～29％；3级：病斑融合成大病斑，病斑面积占整叶面积的30～50％；4级：病斑很多融合成大病斑，病斑面积占整叶面积50％～70％，片斑干枯；5级：病斑面积占整个叶面积的70％以上，几乎整片叶焦枯死亡。
[0119]
病情指数(di)＝(∑发病级数
×
发病株数)/(最高病级
×
总株数)
×
100；防治效果/％＝对照病情指数(ck)-处理病情指数/对照病情指数(ck)
×
100。
[0120]
表6不同处理对带菌苗防治效果
[0121]
处理病情指数防治效果(％)ck87.110t1149.63-71.77t298.89-13.52t331.1164.29t437.7756.63
[0122]
由表6记载的可知，选取抑制作用最强的制剂9(150mg/ml实葶葱花序丙酮浸提液)进行带菌苗期防治试验，带菌幼苗经处理后，5组甜瓜植株表现出不同程度的病害。在幼苗长至1片真叶后，第1d接菌，在接菌2d后进行第1次喷施处理，5d后，有部分植株子叶边缘出现棕褐色斑点，真叶表面出现小而密集的白色圆点状病斑。在接菌4d后第2次喷施处理，11d后，病害发展迅速，病情达到稳定状态，子叶病斑从边缘向内延伸呈水浸状，真叶表面叶背面的白色小圆病斑形成深褐色不规则大病斑，有病叶干枯脱落，发病情况严重的植株完全干枯。t1病情指数最高，t3与t4病情指数低，说明t1带菌幼苗发病情况增强，化学试剂促使病害发生，t3与t4带菌幼苗发病情况减弱。表明t3与t4相比于ck、t1、t2对带菌幼苗具有更好的防治效果，且t3发病率更低。统计发病情况结束第15d观察，ck与t1病株完全干枯，t2大部分病株完全干枯仅少部分呈3级，t3与t4植株大部分植株未发病，少部分发病植株呈1或2级。因此不论做单一杀菌剂，还是混合杀菌剂，在植株发病时期能够抑制病原菌的生长，降低发病率，比1％次氯酸钠、46％氢氧化铜对bfb有更好的防效。
[0123]
综上所述，本发明所述制剂对细菌性病害的病原菌的增殖生长存在抑制作用，尤其是西瓜食酸菌，同时具有不易使病原菌产生抗性，无污染的优势。而且本发明所述实葶葱花序提取物是从植物中提取得到的活性成分，属于植物源杀菌物质，具有比化学农药更环保、高效、低毒或无毒、易降解、选择性高、不产生抗药性等优点，因此，本发明所述实葶葱花序提取物的应用能够减少化学农药的施用，降低化学农药对人体与动植物的潜在危害，增强植物的抗病性，可提高作物产量和品质。本发明所述技术方案在甜瓜生产大省对细菌性病害防治上具有重要作用。
[0124]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些
实施例都属于本发明保护范围。