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栀子花提取物及其应用

花匠小妙招
2024-11-16 12:12

1.本文涉及栀子花提取物，还涉及栀子花提取物改善体成分和/或运动能力的新用途。

背景技术：

2.栀子(gardenia jasminoides)，又名山栀子，属于茜草科栀子属植物，是一种小型常绿灌木。栀子生于山野，适应性强，主要分布于热带和亚热带地区。
3.栀子果实含有丰富的色素成分，被广泛用作食品添加剂或工业染料。栀子果实也是传统中药，具有利胆消炎的作用，临床上用于治疗胆囊炎、黄疸型肝炎等。
4.栀子花(指其花朵，以下同)呈白色或黄色，香气浓郁。栀子花是一种名贵的天然香料，其所含的有效成分作为高档香料应用于各种产品中，有清热泻火、治疗热病、减轻压力、保湿滋润肌肤之效。据研究，栀子花挥发油的主要成分为芳樟醇、茉莉内酯、金合欢烯、β-香叶烯、苯甲酸甲酯、罗勒烯等。
5.尽管如此，栀子花的其他新用途仍有待开发。

技术实现要素：

6.在一方面，本文提供了一种栀子花提取物，其通过如下步骤制备：
7.1)取新鲜栀子花，粉碎后在水中超声处理1-2h；
8.2)将步骤1)经超声处理的混合物以乙醚萃取；以及
9.3)去除乙醚，得到所述栀子花提取物。
10.另一方面，本文提供了改善受试者体成分或运动能力的方法，包括向所述受试者施用有效量的栀子花提取物。
11.在一些实施方案中，所述栀子花提取物为栀子花的有机溶剂(例如乙醇，乙醚)提取物。在另一些实施方案中，所述栀子花提取物为栀子花经co2超临界萃取获得的提取物。在另一些实施方案中，所述栀子花提取物为通过上文描述的步骤制备的栀子花提取物。
12.在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优选人，包括健康人，例如运动员、健美爱好者、减肥人员。在另一些实施方案中，所述受试者为患者，例如老年痴呆患者，优选早期老年痴呆患者。在另一些实施方案中，所述受试者为肌肉受损后需要进行肌肉康复的人员。
13.在一些实施方案中，其中所述体成分包括脂肪含量或肌肉脂肪比值，所述运动能力包括肌肉力量、运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。所述改善受试者体成分包括降低脂肪含量和/或增加肌肉脂肪比值。所述改善运动能力包括增加肌肉力量、耐力、运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。
14.在一些实施方案中，所述栀子花提取物通过芳香疗法施用至所述受试者。
15.另一方面，本文提供了栀子花提取物作为改善受试者体成分或运动能力的保健品的应用。换言之，本文提供了一种非医疗目的的改善受试者体成分或运动能力的方法，其包
括对所述受试者施用栀子花提取物。
16.在一些实施方案中，所述栀子花提取物为栀子花的有机溶剂(例如乙醇，乙醚)提取物。在另一些实施方案中，所述栀子花提取物为栀子花经co2超临界萃取获得的提取物。在另一些实施方案中，所述栀子花提取物为通过上文描述的步骤制备的栀子花提取物。
17.在一些实施方案中，所述受试者为哺乳动物，优选人，包括健康个体，例如运动员、健美爱好者、减肥人员。
18.在一些实施方案中，其中所述体成分包括脂肪含量或肌肉脂肪比值，所述运动能力包括肌肉力量、运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。所述改善受试者体成分包括降低脂肪含量和/或增加肌肉脂肪比值。所述改善运动能力包括增加肌肉力量、耐力、运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。
19.在一些实施方案中，所述保健品通过芳香疗法施用至所述受试者。
20.在一些实施方案中，所述保健品为减肥制剂。
21.在一些实施方案中，所述保健品为可吸入制剂形式。
22.另一方面，本文提供了栀子花提取物在制备用于改善受试者体成分或运动能力的药物中的应用。
23.在一些实施方案中，所述栀子花提取物为栀子花的有机溶剂(例如乙醇，乙醚)提取物。在另一些实施方案中，所述栀子花提取物为栀子花经co2超临界萃取获得的提取物。在另一些实施方案中，所述栀子花提取物为通过上文描述的步骤制备的栀子花提取物。
24.在一些实施方案中，所述受试者为患者，例如老年痴呆患者，优选早期老年痴呆患者。在另一些实施方案中，所述受试者为肌肉受损后需要进行肌肉康复的人员。
25.在一些实施方案中，其中所述体成分包括脂肪含量或肌肉脂肪比值，所述运动能力包括肌肉力量、运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。所述改善受试者体成分包括降低脂肪含量和/或增加肌肉脂肪比值。所述改善运动能力包括增加肌肉力量、耐力、运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。
26.在一些实施方案中，所述栀子花提取物通过芳香疗法施用至所述受试者。
27.在一些实施方案中，所述药物为可吸入制剂形式。
28.本文提供了栀子花提取物可通过芳香疗法明显改善受试者的体成分和/或运动能力。
附图说明
29.图1显示了芳香干预对小鼠体重的影响。随时间变化，各组小鼠体重缓慢增加，各组间无显著性差异。实验数据以均数表示。
30.图2显示了芳香干预对小鼠体成分的影响。(a)芳香干预后，脂肪含量的变化。(b)芳香干预后，肌肉与脂肪含量的比例变化。实验数据以均数
±
标准误表示；与实验组比较，*p＜0.05。
31.图3显示了芳香干预对痴呆模型小鼠体重的影响。(a)随时间变化，短中期芳香干预对体重的影响。(b)短中期芳香干预结束后，体重观察。(c)随时间变化，长期芳香干预对体重的影响。(d)长期芳香干预结束后，体重观察。实验数据以均数或均数
±
标准误
表示；与模型组比较，*p＜0.05，**p＜0.01。
32.图4显示了芳香干预对痴呆模型小鼠体成分的影响。(a)长期芳香干预对肌肉含量的影响。(b)长期芳香干预结束后，对脂肪含量的影响。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
33.图5显示了芳香干预对小鼠抓力的影响。(a)芳香干预7天后，观察小鼠抓力的最大值和平均值。(b)芳香干预15天后，观察小鼠抓力的最大值和平均值。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，**p＜0.01，***p＜0.001。
34.图6显示了芳香干预对小鼠入水后的运动反应时间的影响。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
35.图7显示了芳香干预对小鼠自游泳的影响。(a)芳香干预15天后，观察小鼠自游泳的游泳距离。(b)芳香干预15天后，观察小鼠自游泳的游泳速度。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
36.图8显示了芳香干预对小鼠负重游泳的影响。(a)芳香干预15天后，观察小鼠负重游泳的游泳距离。(b)芳香干预15天后，观察小鼠负重游泳的游泳速度。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
37.图9显示了芳香干预对痴呆模型小鼠自发运动能力的影响。(a)短中期芳香干预后，自发运动距离。(b)短中期芳香干预后，自发运动速度。(c)长期芳香干预后，自发运动距离。(d)短中期芳香干预后，自发运动速度。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
38.图10显示了芳香干预对痴呆模型小鼠运动平衡能力的影响。(a)芳香干预后1小时，小鼠在转棒上的停留时间。(b)芳香干预后3小时，小鼠在转棒上的停留时间。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
39.图11显示了芳香干预对痴呆模型小鼠后肢血流速度的影响。实验结果为芳香干预6个月后各组小鼠后肢血流速度。实验数据以均数
±
标准误表示；与模型组比较，*p＜0.05。
具体实施方式
40.除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
[0041]“栀子花提取物(gardenia extract)”指通过让液体试剂(水或有机物)与栀子花接触，使得栀子花中的至少部分化学成分进入所述液体试剂中而获得的混合物。通常可以在栀子花与液体试剂接触之前将其粉粹，以与液体试剂充分接触。为了充分提取或加快提取速度，还可以在提取过程中采用升温、微波或超声方式处理。在本文的一些实施方案中，所用的液体试剂为有机溶剂，例如乙醚或乙醇。这种情况下，待乙醚或乙醇挥发后，可得到油状的包括多种成分的栀子花提取物。其具有芳香气味，也可称为“栀子花精油(gardenia essential oil)”。栀子花提取物本身具有挥发性，当其处于非密封状态时部分成分可进入
空气中。
[0042]“体成分(body composition)”在本文中指受试者的身体组成，包括肌肉、骨骼、水、脂肪等在身体中的含量，尤其是脂肪含量(脂肪重量与体重的比值)。在一些情况下，体成分也指身体肌肉与脂肪之间的相对含量，即身体中肌肉与脂肪重量的比值。因此，当提及“改善体成分”时，指身体中脂肪含量降低和/或肌肉脂肪比值增加。
[0043]“芳香疗法(aromatherapy)”，也可称为“芳香干预(aroma intervention)”或“熏香法(fumigation)”，指让受试者与挥发性制剂(精油，如上述栀子花提取物)共处于一定空间范围内，使得受试者可通过吸入方式接受至少部分的该挥发性制剂。可通过多种方式进行芳香疗法，例如，熏蒸法(采用熏香灯)、嗅吸法(将挥发性制剂滴在诸如手帕的织物上，再放入鼻孔附近吸入，或滴鼻剂、鼻贴等滴入或贴于鼻内部)、佩戴香囊，等等。本领域已知还可采用一些雾化装置才促进受试者吸取精油成分。需要指出的是，当提及芳香疗法时，并不表明其必然是用于特定疾病的治疗目的，而是还可以用于改善受试者的健康状态，例如降低脂肪含量或增加肌肉力量，具有健美或保健效果。
[0044]
用在本文时，“保健品”指可改善受试者状况的非药物制剂。当栀子花提取作为保健品或与其他组分混合后作为保健品使用时(例如减肥制剂)，意味着其作为非药物制剂施用至健康受试者，涉及栀子花提取物的非治疗用途。
[0045]
用在本文时，“药物”指可改善受试者状况的药物制剂。当栀子花提取作为药物品或与其他组分混合后作为药物使用时，意味着其作为药物制剂施用至患有某种疾病或具有某种疾病风险的受试者，涉及栀子花提取物的治疗用途。
[0046]
用在本文时，“受试者(subject)”指各种化学或药物制剂作用的对象，包括各种脊椎动物，例如哺乳动物和鸟类，优选灵长类动物，更优选人。该术语通常可以和与“个体”、“检测对象”、“治疗对象”等互换使用。受试者可以为患者，也可以为健康个体。
[0047]
当提及栀子花提取物的用量时，“有效量(effective amount)”指足以在受试者体内引起所期望的生物学或医学效果的量，可通常由本领域技术人员根据受试者个体情况，如体重、年龄、身体状况等因素来确定。当确定“有效量”时，不仅考虑每次施用时受试者所接触的栀子花提取物的浓度，还应考虑受试者接触栀子花提取物的持续时间。
[0048]
在本领域，技术人员已知栀子花提取物具有多种功能，例如抗炎、解热、镇静、护肝等作用。本发明人在研究过程中意外发现栀子花提取物还可改善实验动物的体成分以及运动机能。
[0049]
在一些实施方案中，本文提供了栀子花提取物降低受试者体内脂肪含量(例如减肥)的用途。该受试者可为健康动物或人群，也可为肥胖群体。这可通过让受试者嗅吸栀子花提取物来实现。例如，当受试者为动物(如鼠、狗、猫、猪、牛、羊)时，可以在饲养场或饲养棚中放置栀子花提取物；当受试者为人时，可以在居住场所、办公场所或运动场所放置栀子花提取物。当栀子花提取物为非密封状态时，部分成分可通过挥发进入空气中，被受试者吸入，实施芳香疗法。该芳香疗法实施周期通常为7天或更长时间，例如15天、30天、3月、6月或更长时间。优选地，该受试者为老年痴呆(ad)患者，更优选早期老年痴呆患者。
[0050]
在另一些实施方案中，本文提供了栀子花提取物增加受试者体内肌肉脂肪含量比值(例如健美或保健)的用途。该受试者可为健康动物或人群，也可为肥胖群体。这可通过让受试者嗅吸栀子花提取物来实现。例如，当受试者为动物(如鼠、狗、猫、猪、牛、羊、猴)时，可
以在饲养场或饲养棚中放置栀子花提取物；当受试者为人时，可以在居住场所、办公场所或运动场所放置栀子花提取物。当栀子花提取物为非密封状态时，部分成分可通过挥发进入空气中，被受试者吸入，实施芳香疗法。该芳香疗法实施周期通常为7天或更长时间，例如15天、30天、3月、6月或更长时间。优选地，该受试者为老年痴呆患者，更优选早期老年痴呆患者。
[0051]
在另一些实施方案中，本文提供了栀子花提取物增加受试者体内肌肉力量的用途。该受试者可为健康动物或人群(例如运动员)，也可为需要增加肌肉力量的患者(例如肌肉损伤恢复期的患者)。这可通过让受试者嗅吸栀子花提取物来实现。例如，当受试者为动物(如鼠、狗、猫、猪、牛、羊)时，可以在饲养场或饲养棚中放置栀子花提取物；当受试者为人时，可以在居住场所、办公场所或运动场所放置栀子花提取物。当栀子花提取物为非密封状态时，部分成分可通过挥发进入空气中，被受试者吸入，实施芳香疗法。该芳香疗法实施周期通常为7天或更长时间，例如15天、30天、3月、6月或更长时间。优选地，该受试者为老年痴呆患者，更优选早期老年痴呆患者。
[0052]
在另一些实施方案中，本文提供了栀子花提取物增加受试者运动能力的用途。该运动能力包括但不限于运动反应能力、自发活动能力和/或运动平衡能力。该受试者可为健康动物或人群(例如运动员)，也可为需要增加运动能力的患者(例如肌肉损伤恢复期的患者)。这可通过让受试者嗅吸栀子花提取物来实现。例如，当受试者为动物(如鼠、狗、猫、猪、牛、羊)时，可以在饲养场或饲养棚中放置栀子花提取物；当受试者为人时，可以在居住场所、办公场所或运动场所放置栀子花提取物。当栀子花提取物为非密封状态时，部分成分可通过挥发进入空气中，被受试者吸入，实施芳香疗法。该芳香疗法实施周期通常为7天或更长时间，例如15天、30天、3月、6月或更长时间。优选地，该受试者为老年痴呆患者，更优选早期老年痴呆患者。
[0053]
在另一些实施方案中，本文提供了栀子花提取物在制备用于改善受试者体成分或运动能力的保健品中的应用。在其他一些实施方案中，本文提供了栀子花提取物在制备用于改善受试者体成分或运动能力的药物中的应用。本文提供的栀子花提取物可直接作为保健品或药物使用，或者可与其他常用药物载体一起配制为可吸入制剂。视需要，可在栀子花提取物中加入一些促进或减弱挥发的物质。
[0054]
本发明人还预期该栀子花提取物可改善受试者(如运动员)的体育成绩，或者改善体力劳动者的劳动能力。
[0055]
鉴于本文提供的栀子花提取物为通过有机溶剂提取的，发明人认为其中的主要成分应该为脂溶性组分，再结合其挥发性，可认为该栀子花提取物的上述用途或作用是通过其中的一种或多种挥发性脂溶性分子起作用的。
[0056]
另外，尽管发明人认为该栀子花提取物是通过吸入进入受试者体内，但也并不排除有部分成分会通过皮肤或粘膜渗透入受试者血液和组织。
[0057]
以下通过具体实施例进一步阐述本发明。
[0058]
实施例1乙醚萃取法制备栀子花提取物
[0059]
本实施例采用乙醚萃取法制备栀子花提取物。
[0060]
取新鲜栀子花100-300g，粉碎后置于挥发油萃取器中，加5-8倍量去离子水，设置超声功率100-200w，超声粉碎1-2h；加8-30倍无水乙醚萃取；萃取后，利用适量无水硫酸钠
干燥，挥尽乙醚，得浅黄色具有芳香气味精油约0.5-3ml，避光、密封，4℃下保存。
[0061]
实施例2栀子花提取物芳香干预对野生型小鼠体成分的影响
[0062]
本实施例通过体成分分析实验，评价芳香干预对野生型小鼠体成分的影响。
[0063]
2.1材料
[0064]
实验动物：野生型c57小鼠，雄性，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。动物实验严格遵守北京中医药大学动物伦理委员会要求，伦理编号bucm-4-2020093002-3096。
[0065]
芳香试剂：实施例1制备的栀子花提取物。
[0066]
仪器：核磁共振(mri)脂肪测量仪(汇佳生物科技(上海)有限公司)、电子天平。
[0067]
2.2方法
[0068]
分组及芳香干预：一共三组，包括野生型组(不进行芳香干预)、芳香干预7天组、芳香干预15天组，每组12只，6只/笼。芳香干预1次/天，2小时/次。芳香干预方法：芳香干预过程中，小鼠饲料撤掉。鼠笼大小39cm
×
18cm
×
18cm，每个鼠笼独立通气，取3-5ul栀子花提取物滴在塑料片上，均匀铺开，贴于鼠笼内壁。芳香干预期间，全程保持安静。野生型对照组不使用栀子花提取物进行芳香干预。
[0069]
体质量和体成分测定：在芳香干预完成后的次日，使用电子天平测量小鼠体重，使用脂肪测量仪检测小鼠的脂肪和肌肉含量。
[0070]
2.3结果
[0071]
芳香干预期间各组小鼠活泼，精神状态好，皮毛光滑，未见明显不良反应。各组小鼠体重均缓慢增加；芳香组未见体重波动变化，表明芳香疗法具有一定的安全性(图1)。
[0072]
进一步体成分分析发现，与野生型组相比，芳香7天干预和芳香15天干预后，小鼠脂肪含量显著性减少(图2a)；与野生型组相比，芳香7天干预和芳香15天干预后，小鼠肌肉与脂肪含量的比值显著性增加(图2b)。结果表明芳香干预可以减少脂肪含量，促进肌肉脂肪比增加。
[0073]
实施例3栀子花提取物芳香干预对痴呆模型小鼠体成分的影响
[0074]
本实施例通过体成分分析实验，评价芳香干预对痴呆模型小鼠体成分的影响。
[0075]
3.1材料
[0076]
实验动物：转基因动物app/ps1双转基因小鼠(老年痴呆模型小鼠)和同窝野生型小鼠，雄性，购自南京大学模式动物研究所，实验动物使用许可证号：scxk(苏)2018-0008、syxk(苏)2018-0027。动物实验严格遵守北京中医药大学动物伦理委员会要求，伦理编号bucm-4-2019121002-4080。
[0077]
芳香配方及试剂：实施例1制备的栀子花提取物。
[0078]
仪器：核磁共振(mri)脂肪测量仪(汇佳生物科技(上海)有限公司)、电子天平。
[0079]
3.2方法
[0080]
分组及芳香干预：短中期干预实验分为野生型正常组、转基因模型组、芳香干预1月组、芳香干预1.5月组、芳香干预3月组；长期干预实验分为野生型正常组、转基因模型组、芳香干预6月组。短中期干预实验，芳香干预1次/天，2小时/次；长期干预实验，芳香干预每4天1次，2小时/次。每组小鼠6只。具体干预方法同实施例2。
[0081]
体质量和体成分测定：在芳香干预完成的次日，使用电子天平测量小鼠体重，使用脂肪测量仪检测小鼠的脂肪、肌肉含量。
[0082]
3.3结果
[0083]
芳香干预期间各组小鼠活泼，精神状态好，皮毛光滑，未见明显不良反应。各组小鼠体重均缓慢增加；芳香组未见体重波动变化，表明芳香疗法具有一定的安全性(图3)。此外，长期芳香干预实验中，我们发现，转基因模型组小鼠体重显著增加；与转基因模型组比较，芳香干预6个月可以显著性减少体重增加(图3d)。
[0084]
进一步体成分分析发现，与正常组相比，模型组小鼠的肌肉含量无显著性变化，但脂肪含量显著性增加；与模型组相比，芳香干预不影响肌肉含量，但显著性减少脂肪含量(图4)，表明脂肪增加是导致模型组小鼠体重增加的重要原因之一，芳香干预可以改善脂肪水平。
[0085]
实施例4栀子花提取物芳香干预对野生型小鼠运动能力的影响
[0086]
本实施例通过行为学实验，评价芳香干预对野生型小鼠运动能力的改善作用。
[0087]
4.1材料
[0088]
实验动物：野生型c57小鼠，雄性，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司。动物实验严格遵守北京中医药大学动物伦理委员会要求，伦理编号bucm-4-2020093002-3096。
[0089]
芳香配方及试剂：实施例1制备的栀子花提取物。
[0090]
仪器：抓力检测器、水箱激光多散斑成像(德国徕卡公司)。
[0091]
4.2方法
[0092]
分组及芳香干预：野生型组、芳香干预7天组、芳香干预15天组，每组12只。芳香干预1次/天，2小时/次。具体芳香干预方法同实施例2。在芳香干预完成的次日进行如下实验。
[0093]
抓力实验：打开抓力测试仪，调零。打开minitr软件，选择“通用
”‑“
处理方法
”‑“
张力”。开始测量，将小鼠放置于抓力网，迅速拉动小鼠至到离开抓力网。每只小鼠测量3-5次。
[0094]
自游泳实验：水箱长80cm宽60cm水深30cm，水温保持恒定，25
±
2℃，将小鼠轻柔放入水面中心，同时进行摄像和计时，记录10min后停止摄像。更换动物，继续实验。利用计算机软件分析小鼠在水中的运动路程、速度等，其中将观察到的小鼠入水至开始游动的时间，记录为运动反应时间。
[0095]
负重游泳实验：水箱长80cm宽60cm水深30cm，水温保持恒定，25
±
2℃，水箱上方150cm处设置一摄像头。小鼠尾部悬吊体重6％的金属重物，将小鼠轻柔放入水面中心，同时开始视频采集。记录5min内小鼠游泳的路程和速度，出现鼻孔沉没入水5s的情况则停止记录，更换动物。
[0096]
统计学分析：实验数据均以平均值
±
标准误表示，应用graphpad统计学软件，采用one-way anova检验，比较各组间的显著性差异，其中方差齐性采用lsd检验，方差非齐性采用dunnett's t3检验，p《0.05表示有统计学意义。
[0097]
4.3结果
[0098]
如图5-8所示，芳香干预7天或15天后，无论是最大抓力还是平均抓力，芳香干预组均显著大于野生型正常组(无芳香干预组)，这提示芳香干预可增强正常小鼠肌肉力量。芳香干预15天后，无论是入水的运动反应时间、自游泳距离还是自游泳速度，芳香干预组均显著优于野生型正常组，这提示芳香干预可改善正常小鼠运动能力。芳香干预15天后，无论是负重游泳距离还是负重游泳速度，芳香干预组均显著大于野生型正常组，这进一步提示芳香干预可改善正常小鼠运动能力。
[0099]
实施例5栀子花提取物芳香干预对痴呆模型小鼠运动能力的影响
[0100]
本实施例通过行为学实验，评价芳香干预对痴呆小鼠运动能力的改善作用。
[0101]
5.1材料
[0102]
实验动物：转基因动物app/ps1双转基因小鼠和同窝野生型小鼠，雄性，购自南京大学模式动物研究所，实验动物使用许可证号：scxk(苏)2018-0008、syxk(苏)2018-0027。动物实验严格遵守北京中医药大学动物伦理委员会要求，伦理编号bucm-4-2019121002-4080。
[0103]
芳香配方及试剂：实施例1制备的栀子花提取物，阿佛丁(10g三溴乙醇与10ml叔戊醇混合，使用灭菌蒸馏水稀释至1.2％，北京翰隆达公司)，fluorescein isothiocyanate-dextran(fitc-dextran，购自sigma公司，货号bcbv4422)。
[0104]
仪器：核磁共振(mri)脂肪测量仪(汇佳生物科技(上海)有限公司)、疲劳转棒仪(香港友诚生物科技有限公司)、双光子显微镜tcs sp5(德国徕卡公司)。
[0105]
5.2方法
[0106]
分组及芳香干预：短中期干预实验分为野生型正常组、转基因模型组、芳香干预1月组、芳香干预1.5月组、芳香干预3月组；长期干预实验分为野生型正常组、转基因模型组、芳香干预6月组。短中期干预实验，芳香干预1次/天，2小时/次；长期干预实验，芳香干预每4天1次，2小时/次。每组小鼠6只。芳香干预方法同实施例2。除非另有说明，在芳香干预完成的次日进行如下实验。
[0107]
旷场实验：检测小鼠的自发运动能力和焦虑情况，旷场箱是50x50x50 cm的不透明箱子，底面平均分成25个10
×
10cm的正方形格。实验时，将各组小鼠放在旷场箱底板的中心，打开摄像头录制5min。记录小鼠在整个旷场及中间区域(中间9格)的行走路程(cm)、时间(s)和平均速度(cm/s)。每只实验完成后，用清水擦拭旷场箱底面。
[0108]
转棒实验：检测小鼠运动耐力。先让小鼠适应转棒环境，将小鼠放置在静止的转棒上适应3min,随后将转速调至5r/min,让小鼠在转棒上适应3min。实验时，将转棒的转速在5min内从4r/min匀速增加至40r/min。在小鼠芳香干预完成后的1h和3h时分别进行转棒实验检测，当小鼠从转棒上掉落时,记录小鼠掉落时在转棒上所停留的时间(s)及掉落时转棒速度(r/min)，测量3次，取平均值。
[0109]
后肢血流检测：采用激光共聚焦显微镜观测小鼠后肢微血管血流速度。麻醉剂阿佛丁按照0.6ml/20g的剂量麻醉小鼠，随后用脱毛膏将其后肢脱毛。用胰岛素注射器从小鼠眼静脉窦注射200ul fitc-dextran后，将小鼠放在激光共聚焦显微镜上，使后肢脱毛处皮肤贴近镜头，寻找毛细血管(直径小于8um)的血流，并记录血流速度。每条血管的血流速为该血管上三处血流的平均值。
[0110]
统计学分析：实验数据均以平均值
±
标准误表示，应用graphpad统计学软件，采用one-way anova检验，比较各组间的显著性差异，其中方差齐性采用lsd检验，方差非齐性采用dunnett'st3检验，p《0.05表示有统计学意义。
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5.3结果
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旷场实验用于检测小鼠的自发活动能力。短中期芳香干预实验发现，各组小鼠的自发运动距离和运动速度无显著性差异(图9a和9b)。长期芳香干预实验发现，模型组小鼠的自发运动距离和运动速度显著低于野生型小鼠，但芳香干预显著性增加自发运动距离和
运动速度(图9c和9d)。
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由于长期芳香干预可以改善痴呆小鼠自发运动能力，我们利用转棒实验，进一步观察小鼠的运动平衡能力。芳香干预后，分别检测1小时后和3小时后，小鼠在转棒上的停留时间。研究发现，与野生型相比，模型组停留时间显著减少；芳香干预可以显著提高痴呆小鼠在转棒上的停留时间(图10)。
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接着，利用双光子检测技术，我们发现芳香干预后可以显著性促进小鼠后肢血流速度(图11)。
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这些研究结果表明，长期芳香干预可以有效改善痴呆小鼠的自发运动能力和运动平衡能力。