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PCR 相关技术方法在植物病害检测中的应用( 综述)

花匠小妙招
2024-11-18 03:52

收稿日期:2004-05-26初稿;2004-10-26二改稿。*上海市科学技术委员会科技攻关计划(03dz19314)资助项目。作者简介:王娜,女,1980年7月出生,陕西师范大学硕士研究生,从事植物病害研究。**通讯作者。上海农业学报2004,20(4):112~115ActaAgriculturaeShanghai

文章编号:1000-3924(2004)04-112-04PCR相关技术方法在植物病害检测中的应用(综述)*王娜1,2)马雅军2)**王吉吉之1)代光辉3)(1)陕西师范大学生命科学学院,西安710062;2)第二军医大学病原生物学教研室,上海200433;3)上海交通大学农业与生物学院,上海201101)摘要PCR和建立在PCR基础上的分子生物学技术以其灵敏、快速、简便等优点在植物病害检测中得到了广泛应用。本文综述PCR相关技术(RT-PCR、IC-PCR、PCR-SSCP、实时荧光PCR、RAPD和RFLP)的原理及其在植物病害检测中的应用现状,同时概述我国已检测的植物病害病原体的种类。关键词PCR;植物病害;检测中图分类号:S431.9文献标识码:A植物病害的检测方法很多,传统的病原学检测方法通常是通过肉眼或借助显微镜查找病原体、观察其形态,以确定病害的类型[1]。随着科学技术的发展,新的技术方法(免疫技术和PCR技术)不断引入该领域[2]。但由于植物病害的病原体株系多、血清类型多,漏检问题难以避免,而且血清学反应的特异性迄今仍不甚满意,从而使免疫技术在大范围内的实际应用受到制约。PCR及其相关技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研究[3]。植物病害的多样性及复杂性已使常规的PCR技术较难满足需要,加之PCR技术本身的快速发展,给植物病害病原体的检测提供了更多可供选择的方法,如:反转录聚合酶链式反应、免疫捕捉PCR、PCR-单链构型多态性、实时荧光PCR、随机扩增多态性DNA和限制性片段长度多态性等。本文拟综述以上PCR相关技术的原理及其在植物病害检测中的应用现状。1.反转录聚合酶链式反应(ReversetranscriptionPCR,RT-PCR)大部分植物病毒、类病毒的核酸是RNA,要应用PCR检测RNA类型的病原体,需先将RNA反转录成cDNA,再以此为模板进行扩增,即RT-PCR。RT-PCR在植物病毒病害的检测方面有较多研究。王朝辉等(2001)[4]利用RT-PCR、斑点杂交法和聚丙烯酰胺凝胶电泳3种方法同时检测水稻黑条矮缩病毒,结果显示RT-PCR是斑点杂交法灵敏度的10倍。陈建军等(2003)[5]比较RT-PCR、IC-RT-PCR(Immuno-capturereversetranscriptasepolymerasechainreaction)和DAS-ELISA(Doubleantibodysandwichenzyme-linkedimmunosorbentassay)3种检测葡萄卷叶病毒Ó的方法,显示RT-PCR可用来检测病毒含量极低的或其它两种方法无法检测出的病毒,在灵敏性和可靠性上均为最佳。叶明等(2002)[6]根据Taq酶既有聚合酶活性又有反转录酶活性的特点,发现在Taq酶单独作用下可完成RT-PCR扩增,反转录阶段退火温度在37e、循环数不少于10次的情况下,可得到马铃薯纺锤块茎类病毒的特异条带,单酶法RT-PCR检测的步骤更为简单,且成本低廉。2.免疫捕捉PCR(Immunocapture-PCR,IC-PCR)PCR技术在检测中病原体时常见的难题是模板核酸的含量较低和纯化的问题,常规核酸抽提程序不易去除植物的多糖、多酚成分,而这些化合物对PCR扩增有抑制作用。IC-PCR是在进行PCR之前对反应模板进行改良,利用病原体和其抗血清的特异性结合,对病原体进行捕捉和富集,可提高灵敏度。陈建军等(2003)[5]在检测葡萄卷叶病毒Ó时,比较了常规的RT-PCR和IC-RT-PCR技术,发现RT-PCR不很稳定,易受环境、实验仪器和实验员身体上RNA酶的影响,植物组织中蛋白质、DNA和多糖也直接影响实