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菊花微卫星位点引物开发及遗传多样性分析

花匠小妙招
2024-11-19 21:07

菊花微卫星位点引物开发及遗传多样性分析

菊花(Chrysanthemum morifolium)是菊科(Compositae)菊属(Chrysanthemum)植物,起源于中国,是中国传统十大名花之一和世界四大切花之一。中国的菊花野生资源和栽培品种十分丰富,其瓣型花型变异繁多。目前,人们对我国菊花资源还缺乏严格系统性的研究,品种混乱,同名异物、同物异名现象严重；其遗传背景复杂、亲缘关系混乱,使育种工作受到多方面限制。近年,分子标记技术发展迅速,已逐渐应用于菊花的亲缘关系分析、遗传多样性评估、品种鉴定、基因标记等多个方面。SSR简单序列重复标记(Simple sequence repeat),亦叫微卫星序列重复,是一类由几个核苷酸(1—6个)为单位经多次重复形成长达几十个核苷酸的重复序列,普遍分布在染色体中。相比其他DNA分子标记,SSR分子标记具有更高的多态性,但有关菊花微卫星标记的开发和应用还是处于空白阶段。本研究以磁珠富集法开发菊花微卫星位点,分别取T3和T2富集文库转化后所得克隆330个和206个进行菌液繁殖,通过PCR方法对文库进行直接筛选,分别获得144个和118个含微卫星位点的阳性克隆,经测序分析共获得了183个菊花微卫星序列。T3富集文库所得的微卫星序列主要是(CT)n、(GA)n、(TG)n (GA)n、(CT)n(CA)n等(5≤n≤40),以两个碱基重复为主；而T2富集文库所得微卫星序列主要是(CAT)n、(TCA)n、(GAT)n等(4≤n≤18),以三个碱基重复为主。利用DNAman分析统计后得到88个完整的可用于引物设计的微卫星序列,共设计了142对引物。为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。建立了菊花基因组DNA SSR-PCR反应25ul体系：60ng模板DNA、2.0mmol·L-1Mg2+、O.lmmol·L-1dNTP、0.3umol·L-1引物、1U Taq酶。并对菊花微卫星引物进行梯度退火实验,最佳退火温度53.1℃；扩增程序：95℃预变性5min；36个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s；72℃延伸8min,4℃保存。通过以3个大菊品种(紫如意、金葵向阳、彩龙爪)基因组DNA为模板,利用优化的SSR-PCR体系对142对引物进行初步筛选,选出54对扩增产物条带清晰可辨的引物。进一步采用8个菊花品种(紫如意、金葵向阳、彩龙爪、天女歌曲、黄越山、紫云、老僧依、老墨荷)对这54对引物的多态性检测,通过6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测后选取扩增稳定性良好、产物丰富的引物,最终筛选得到10对用于菊花多态性分析的SSR引物。利用上述10对SSR引物对88个菊花品种及其近缘属植物进行了遗传多样性分析,共扩增出3118条带,其中多态性带2630条,平均多态性74.12%；特异性条带42条,占总条带的1.35%；88份试验材料之间的相似性系数是0.5322-0.8750。两个观赏大菊品种‘国华金大社’和‘国华强大’相似性系数最高,为0.8750,它们都为匙瓣类匙球型,。根据所统计的SSR分子标记数据利用UPGMA法进行了聚类分析,88试验品种分为两大类：第1类含7个小菊种和2个菊属近缘种,毛华菊和亚菊属的太平洋亚菊较早聚在一起,再与紫花野菊聚为一支；余下5个小菊种和1个太行菊属种长裂太行菊聚为一支,茶菊品种杭白菊、金竹贡菊和全椒滁菊较早聚在一起,而毫菊与长裂太行菊和蒙菊则较早地聚在一起。第Ⅱ类含79个大菊品种,包括52个中国传统大菊和27个日本引进大菊品种,第Ⅱ类可分为两个亚类：第1亚类包含4个桂瓣品种,说明桂瓣品种与其他大菊品种存在较大遗传差异；第2亚类包括75个品种；中国传统大菊和日本引进大菊品种没有区分界线,瓣型可以作为菊花品种分类的标准,聚类结果与花色相关性差。