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Nature Communications| 中山大学李剑峰课题组发现基因编辑可造成植物高频的缺失/倒置双等位变异

花匠小妙招
2024-11-20 14:10

真核生物基因组中广泛存在大量在染色体上串联排列的同源基因，称为tandemly arrayed genes或TAG。TAG在拟南芥、水稻、小麦、杨树、玉米基因组中占比约14~35%，在人和小鼠中占比约14~17%。TAG的功能研究需要同时解决基因功能冗余和染色体连锁两大难题，而CRISPR技术为TAG的功能研究提供了完美的工具。理论上，仅需使用一对gRNA分别靶向TAG的头和尾两个基因，则可将整段携带TAG的染色体删除，从而实现TAG的功能缺失。但值得注意的是，近年来在动植物中陆续发现CRISPR技术在染色体上产生的多个DNA双链断裂（DSB）会诱发染色体的异常变异，如重排、倒置等等。

近日，中山大学生命科学学院李剑峰课题组在Nature Communications发表了题为Hidden prevalence of deletion-inversion bi-alleles in CRISPR-mediated deletions of tandemly arrayed genes in plants的研究论文，报道了在成对的gRNA引导下，CRISPR介导的TAG敲除会引发高频的染色体缺失/倒置双等位变异。该双等位突变体极易被传统基于三引物法的基因型鉴定PCR误判为纯合缺失突变体，继而会给后续的TAG功能研究埋下隐患。

作者首先为了研究拟南芥基因组中编码PEP细胞因子前体（PROPEP）的典型TAG功能，设计了成对的gRNA对串联的多个PROPEP基因进行CRISPR/Cas9敲除，并通过传统三引物法鉴定纯合缺失突变体。所谓三引物法是指先用分别结合于TAG两侧的一对相向引物进行第一次（tier-1）PCR，出现阳性的小分子量PCR条带则说明存在染色体删除；再用分别结合于TAG外侧及内部的一对相向引物进行第二次（tier-2）PCR，无PCR条带则说明缺失正常的TAG序列；两次PCR的结果可共同鉴定出纯合缺失突变体。然而，在对获得的“纯合缺失”突变体进行转录组分析时，作者意外发现位于TAG内部“已被删除”的PROPEP基因仍在表达。结合前述PCR结果与随后进行的TAIL-PCR和Sanger测序，最终发现一条染色体上的TAG已被删除，而另一条同源染色体上的TAG则在两个DSB位点之间发生了倒置，因而tier-2 PCR未能产生PCR条带，引起对基因型的误判。该突变体的子代中，缺失、倒置两种基因型的分离进一步确认了亲代的缺失/倒置双等位突变形式。基于deletion和inversion两个已有术语，该研究将此种新的双等位突变形式命名为delinver突变。

接下来，通过对拟南芥、水稻中多个不同的TAG进行成对gRNA介导的CRISPR/Cas9敲除，在近2650个转基因植株或愈伤组织中，共有31对gRNA成功产生大片段的TAG敲除，其中有27对gRNA能够造成delinver突变。比如，在对编码拟南芥NLR免疫受体AT5G45240/AtRPS4/AtRRS1进行的12组TAG敲除中，某些成对gRNA所诱导的TAG敲除突变体中有高达~80%实际上是delinver突变体，12组的中位数为~51%。Delinver突变的发生与TAG所在的染色体位置、删除片段的大小均无显著相关性，但总体上与该对gRNA所造成的TAG删除效率呈正相关性。此外，切割产生粘末端的CRISPR/Cpf1系统与切割产生平末端的CRISPR/Cas9系统一样，在植物原生质体细胞中也会诱导delinver突变。进一步，作者发现成对gRNA介导的CRISPR敲除在植物基因组的非TAG位点（比如，TAG的相邻区域或者代谢基因簇）也会产生频率相似的delinver突变。这些结果表明，成对gRNA介导的CRISPR敲除在植物基因组上诱导delinver突变是一种普遍现象。为了防止delinver突变体被误判为纯合缺失突变体进而误导TAG的功能研究，作者建议在TAG敲除突变体的基因型PCR筛选时通过一对同向引物进行第三次（tier-3）PCR，其阴性或阳性PCR产物则可分别反映出该突变体是纯合缺失突变体还是delinver突变体。

中山大学博士生刘玖尔和副研究员王凤珠为该论文的共同第一作者，李剑峰教授为通讯作者。博士生李冲、博士后李雨佳参与了该研究。该研究得到国家重点研发计划合成生物学专项等经费资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-42490-1

李剑峰教授课题组长期致力于植物基因编辑技术的研究，首批在模式植物拟南芥中实现CRISPR介导的基因编辑（Nat Biotechnol，2013）；开发了编辑窗口多样化的植物碱基编辑工具箱（Nucleic Acids Res，2022），建立了脱靶效应最小化的高保真碱基编辑器（Nat Plants, 2023）；利用碱基编辑器编辑内含子剪接位点建立了植物基因失活的新策略（New Phytol，2019）；建立了高效的植物基因原位激活系统dCas9-TV（Nat Plants，2017），并利用该系统在水稻中实现对多个内源基因的同时原位激活（JIPB，2021）。

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排版涂佳铃

初审李剑峰邱志琦熊丽娜

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