内生真菌对兰科药用植物种子萌发作用研究进展
兰科Orchidaceae植物包含800余属25 000余种,其中很多种类均具有极高的药用价值。兰科植物种子细小,不含胚乳和子叶,只有分化不完全的微小的原胚,储存在胚中的营养成分不足,有些种子缺少乙醛酸循环体和各种酶系,不能利用自身的营养物质,有些成熟种子会产生脱落酸（abscisic acid,ABA）等对萌发有抑制作用的次生代谢产物（Baskin & Baskin 1998;于雪梅2000）。此外,杓兰Cypripedium calceolus L.和春兰Cymbidium goeringii (Rchb. f.) Rchb. f.等地生兰种子由于种皮过于坚韧而不利于萌发（Lee et al. 2005）,以上因素均导致兰科植物种子萌发困难,萌发率仅在万分之一左右（董芳2008）。自然条件下,真菌对种子的侵染是兰科植物种子正常萌发所必须的,且能够促进其种子萌发与生长的内生真菌都是兰科植物的菌根真菌。大多数兰科植物的种子萌发阶段完全依赖菌根真菌提供营养物质;而幼苗阶段,即还没有光合能力的原球茎或根状茎阶段,同样完全依赖真菌为其提供养分来进行生长发育,被称为最初的真菌异养（Merckx 2013;Stöckel et al. 2014）。兰科植物种子在没有内生真菌时,多数只能萌发到种子吸水膨胀导致种皮破裂阶段（Rasmussen & Whigham 1993）,此时若没有内生真菌,种子即停止生长或死亡,如有内生真菌存在,菌丝体就能够穿过种子种皮,产生淀粉酶使胚内淀粉水解,促使胚原体继续生长,并从周围环境中获得养分,与兰科植物共同利用,促进种子进一步萌发与生长（Smith & Read 2008）。因此,研究内生真菌为兰科药用植物种子萌发提供的营养物质可以为研究内生真菌的促萌发机制提供理论基础,并将促进兰科药用植物种苗快繁途径中有性繁殖技术的发展。
1 兰科植物种子萌发所需的养分来源
1.1 内源养分
兰科植物种子萌发所需的养分来源包括内源养分和外源养分。内源养分即种子内含有的少量营养物质,是启动种子萌发的第一营养源。少数兰科植物,例如万代兰属Vanda植物的种子（Ricardo & Alvarez 1971）,种胚的薄壁细胞中贮存了大量的蛋白质、油脂以及碳水化合物,是兰科植物中在自然条件下较容易萌发的种子类型。而多数兰科植物依靠其自身营养物质难于萌发,外源养分对其种子的萌发具有重要意义。
1.2 外源养分
1.2.1 外源养分的直接来源——消化侵入的菌丝：兰科植物种子可以通过直接消化、分解侵入的内生真菌菌丝体,吸收其成分作为种子萌发的营养物质（Manoharachary & Tilak 2015）。研究者对天麻Gastrodia elata Bl.和铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo等兰科植物种子接菌萌发过程中的细胞超微结构变化进行观察,发现菌丝可从种皮任何部分的细胞间隙穿入到达胚体,由胚柄侵入种胚,染菌的胚细胞质及细胞器逐渐消失,并可见到核崩解;菌丝在侵入初期其细胞结构与功能均正常,随后有些菌丝被胚细胞质包围并加厚,菌丝逐渐失去原有形态,但内含物尚无明显变化;然后质膜内陷产生的囊状体包围菌丝,菌丝崩解,逐渐成为裸露的原生质团,并进一步被胚细胞中的水解酶分解成为碎片;菌丝原生质碎片可以传送到邻近的胚细胞,被进一步分解利用,成为种胚萌发的营养物质;邻近染菌细胞的未染菌胚细胞代谢功能旺盛且细胞器数量增多,体积变大,例如线粒体槽库增多,质网腔变大,液泡吞噬功能增强,与执行营养物质的合成和运输等重要功能相适应（郭顺星和徐锦堂1990a,1991;Chen et al. 2014）。
1.2.2 外源养分的间接来源——菌丝传递作用：菌根真菌可以通过分解有机物,将得到的碳水化合物或其他来源的营养物质经过在兰科植物内部形成的菌丝团与植物细胞的界面传递给种子或原球茎,作为其萌发与生长所需的外源养分。
兰科植物主要分为完全菌根异养植物和部分菌根异养植物,前者无叶绿体,终生需要菌根真菌,后者为成年植株阶段含有叶绿体,可进行自养。自然条件下能够促进完全异养型兰科植物种子萌发的菌根真菌大多可以与邻近的树木形成外生菌根（Liebel & Gebauer 2011;Veldre et al. 2013）,由此建立兰科植物、真菌与树木三者之间的共生网络,在共生萌发过程中,菌根真菌通过与兰科植物以及其他树种的共生作用,可以将其他树种中的碳源转运给兰科植物种子（McKendrick et al. 2000）。例如,完全异养型兰科植物Rhizanthella gardneri R.S. Rogers,既可以通过菌根真菌直接吸收土壤中的碳源、氮源等营养物质,也可以通过菌根真菌与自养型灌木组成三角网络来获得所需养分（Bougoure et al. 2010）;珊瑚兰Corallorhiza trifida Chatel.原球茎的菌根真菌为革菌科Thelephoraceae真菌,同样能与邻近的光合自养植物垂枝桦Betula pendula Roth.和匍匐柳Salix repens L.形成外生菌根,将植物光合作用固定的碳传递给C. trifida（Mckendrick et al. 2000）。由此可见,兰科植物种子萌发所需的最终营养物质主要通过共生萌发菌从死去的植物残体、土壤或活植物体中获得。
2 内生真菌为兰科植物种子萌发提供营养物质
研究表明,内生真菌可以为兰科药用植物种子萌发提供碳源、氮源和氨基酸等多种生长所需的 物质。
2.1 碳素养分
在种子无菌培养时,糖作为碳源是培养基的主要成分,不仅是种胚的营养物质和重要能源,而且可以调节细胞内外的压力,对维持胚生长所需的渗透压可以起到重要作用。采用分离培养系统（split-plate systems）和单独为真菌提供标记葡萄糖的技术研究发现,菌根真菌与兰科植物原球茎之间存在着自真菌流向原球茎的碳流（carbon flow）（Purves & Hadley 1975;Alexander & Hadley 1985）,兰科植物种子与真菌共生萌发时,可以通过消化入侵的菌丝来获得碳源,不同植物获得的碳水化合物的量可以通过控制对真菌的消化途径和速度来调节,这是兰科植物长期与真菌形成共生关系的适应。而部分菌根异养兰科植物在发育成熟后,可以通过光合作用产生碳水化合物,其与菌根真菌的碳流则会转变方向,变成自植物流向真菌,而作为交换,兰科植物则会通过菌根真菌吸收和转运氮和磷等矿物质养分（Cameron et al. 2007;Liebel et al. 2015）。
2.1.1 可溶性糖源：菌根真菌可以吸收植物体外可溶性的糖,或将不溶性的多糖转化成可溶性的糖,吸收或转化成真菌体内特异的二糖——海藻糖,并通过活细胞界面的基质运输给植物细胞,被吸收利用,促进兰科植物原球茎的生长（Ponert et al. 2013）;也可消化由兰科植物细胞内的脂肪粒或贮藏蛋白转化成的淀粉粒,促进种子与原球茎生长;菌丝团还可发生周期性的消解和再形成,不断向植物供给营养物质,促进幼苗持续生长（Smith 1967;Hadley & Williamson 1971）。
郭顺星和徐锦堂（1990b）自兰科植物原球茎中分离得到7种能够促进铁皮石斛等兰科种子萌发的菌株,对各菌株成分分析表明,7种促萌发真菌均含有较高含量的总糖与还原糖,能够为兰科植物种子提供足够的碳水化合物,结构鉴定发现,石斛小菇Mycena dendrobii Fan et Guo以及粘帚霉属Gliocladium真菌等多种内生真菌均含有D-阿拉伯醇、D-甘露醇等糖醇成分,可能作为种子萌发的碳源（陈晓梅1999;张集慧1999）;分离自兰科植物Dactylorchis pupurella (T. & T.A. Steph.) Vermeul的丝核菌属真菌Rhizoctonia repens Bernard、Rhizoctonia solani Kuhn等均含有葡萄糖、海藻糖和甘露醇等碳水化合物（Smith 1967）,其中海藻糖可以由海藻糖酶分解为葡萄糖,供种胚使用（Knudson 1925）;角担菌属真菌Ceratobasidium cornigerum (Bourdot) D.P. Rogers的菌丝能够将基质中的葡萄糖吸收转化为甘露醇和海藻糖,并以海藻糖的形式转运到刚入侵的小斑叶兰Goodyera repens (L.) R. Br.原球茎中（Hadley 1984）。Johnson et al.（2011）考察碳源、矿物质养分以及光照对Bletia purpurea (Lam) A. DC.种子萌发和早期发育所需的影响,结果发现蔗糖、果糖、葡萄糖和海藻糖均能促进种子萌发和幼苗发育,而甘露醇和山梨醇则没有效果,进一步分析表明,由体内的共生真菌传递的光合产物或由体外提供的外源性糖等碳水化合物,能够满足兰科植物种子萌发的能量需求,调节种子的萌发速率,而相比之下,矿物质养分对于种子萌发则不如碳水化合物重要。此外,有研究发现可溶性糖浓度过高,培养基中的渗透压会变小,导致原球茎因不易吸收营养物质而发生褐化,生长较差（Chen et al. 2002）。
2.1.2 纤维素与淀粉：大多数兰科内生真菌均具有纤维素酶活性,如贵州特色兰科药用植物独蒜兰Pleione bulbocodioides (Franch.) Rolfe、云南独蒜兰Pleione yunnanensis (Rolfe) Rolfe、杜鹃兰Cremastra appendiculata (D. Don) Makino的多种菌根真菌（朱国胜2009）,这些菌根真菌可以以土壤中枯枝树叶中的纤维素为碳源,营腐生生活,也可以寄生于其他植物,营寄生生活,通过转运纤维素水解产物来促进兰科植物种子萌发。同样以纤维素为碳源,对不同的兰科植物种子起促萌发作用的菌根真菌不同,例如胶膜菌属Tulasnella不同菌株对不同属兰科植物种子所起的促萌发作用不同,多种美孢胶膜菌Tulasnella calospora (Boud.) Jue可以促进双尾兰属Diuris种子萌发,而其他多种同为胶膜菌属的真菌则可以促进柱帽兰属Thelymitra种子萌发（Warcup 1973）。
一些无纤维素酶活的菌根真菌,不能以纤维素为碳源,但可以利用淀粉作为碳源与兰科植物建立共培养体系（Mehra et al. 2017）,在以淀粉为碳源的共培养过程中,菌根真菌可以将淀粉粒降解成可溶性的糖类,并使培养基形成一个适宜的pH值,促进兰科植物种子萌发。但在这个共培养系统中,菌根真菌不一定侵入种子或幼苗也可以促进种子的萌发和幼苗的生长,相关研究表明菌根真菌主要通过降解淀粉,进而改变培养基的成分而影响种子的萌发和幼苗的生长（Knudson 1925）,这与纤维素培养基不同,以纤维素为碳源的共培养菌根真菌降解纤维素后,菌根真菌可以吸收降解产物,但必须通过侵入才能将产物运输给兰科植物,这可能与纤维素难分解有关。
对于菌根真菌而言,不同兰科植物的不同菌根真菌对不同碳源的利用存在较大的差异,且不同生长时期的菌根真菌对相同碳源的利用能力也不相同,即使是相同生长期的菌根真菌,有些最适碳源是多糖,例如可溶性淀粉和纤维素,而有些则为单糖或二糖（朱国胜2009）;对于兰科植物种子而言,还原糖类的麦芽糖和甘露糖对某些兰科植物胚的萌发和生长效果优于果糖和非还原性的蔗糖（Arditti 1967）,而Breddy（1953）则认为蔗糖对大多数兰科植物种子萌发均适宜。因此,研究兰科植物种子共生萌发所需碳源的情况,同样需要确定能够供菌根真菌利用的最佳糖源。
2.2 氮素养分
同碳源相似,不同菌根真菌对不同氮源的利用能力也存在多样性,有些菌株的最佳氮源为无机氮,如铵盐和硝酸盐等,而有些为则有机氮（朱国胜2009）。菌根真菌侵染兰科植物后,可以通过分解、吸收和转运土壤中的有机氮化合物,供给自身和植物种子萌发与生长（Cameron et al. 2006）。
对于兰科植物而言,不同种类的氮素养分对兰科种子萌发和原球茎生长具有不同的作用。在种子萌发阶段,研究表明在极低浓度（2mg NO3-·dm-3）硝酸盐的培养条件下,兰科植物Pseudorchis albida (L.) A. Love & D. Love的种子萌发会受到显著抑制（Ponert et al. 2013）。同时,培养基质中铵离子浓度的增加,会阻碍并延缓Serapias neglecta De Not.、Barlia robertiana (Loisel.) P. Delforge等干旱草原兰科种子的萌发（Calevo et al. 2017）。但在原球茎生长阶段,无机氮化合物硝酸钾（硝态氮）可以促进铁皮石斛原球茎鲜重和干重的增加,而硫酸铵（铵态氮）可以促进铁皮石斛原球茎鲜重增加,且无论鲜重还是干重,硝态氮和铵态氮的影响均不存在互作（宋经元等 2008）。与上述无机氮化合物相比,早期原球茎若以谷氨酰胺等有机氮化合物为氮素养分,则可以绕过氮吸收过程中产生硝酸还原酶等环节,从而更好地利用氮素养分（Malmgren 1992;Magrini & de Vitis 2017）。
菌根真菌能够促进兰科植物对氮元素的吸收和利用,促进兰科植物在低氮源的情况下生长（吴慧凤 2011）。但也有研究显示角担菌属真菌可以降低Dactylorhiza majalis (Rchb.) Hunt. et Summerh.和Dactylorhiza incarnata (L.) Soo原球茎对氮源的耐受力,使这两种植物在高浓度硝酸铵培养时生长和成活受到影响,而瘤菌根菌Epulorhiza sp.则没有此作用（Dijk & Eck 1995）。此外,同其他一些植物（赵平等 2005）相似,当氮、钾供应充足时,也可以通过增加植株中促进种子萌发的植物激素（生长素、赤霉素、细胞分裂素等）和叶绿素含量,同时降低ABA的含量,从而间接提高兰科种子的生理活性（吴慧凤2011）。
2.3 氨基酸
内生真菌为兰科植物提供的氨基酸类物质既可以作为种子萌发的碳素养分,又可以作为氮素养分。Harvais（1972）无菌培养兰科植物Dactylorhiza purpurella (T. Stephenson & T.A. Stephenson) Soo发现采用由矿物质、葡萄糖、酪蛋白氨基酸以及酵母提取物组成的培养基培养效果与有菌根真菌共生培养的效果相当,但是仅采用矿物质和葡萄糖组成的培养基培养,则生长效果很差,提示共生真菌可以为兰科植物提供某些氨基酸和维生素类物质。
有研究表明,无菌培养兰科植物离体胚时,具有二元羧酸结构或者带有多个氮原子的长链氨基酸可以作为与硝酸铵等效的氮源,其中门冬氨酸和精氨酸作为培养基中的氮源是非常有效的（Spoerl 1948）。郭顺星和徐锦堂（1990b）自天麻、细叶石斛Dendrobium hancockii Rolfe、见血清Liparis nervosa (Thunb.) Lindl.原球茎中分离得到能够促进石斛类药用植物种子萌发的菌株,分析发现各菌株均含有17种必须氨基酸,氨基酸总量为14.85%-18.08%,且门冬氨酸和精氨酸在各菌株中均有较高含量,均是非常有效的氮源,其中作为可以促进天麻与铁皮石斛种子萌发的优良菌株,紫萁小菇的氨基酸含量最高。
李尚真等（2015）自华石斛Dendrobium sinense T. Tang et F.T. Wang中分离得到胶膜菌属真菌S1,在该菌株的不同营养培养基中均能检测到17种氨基酸,其中脯氨酸、半胱氨酸和赖氨酸3种氨基酸含量远高于其他氨基酸。有研究表明,赖氨酸是多条生化途径代谢的最终产物,可以为兰科种子萌发提供必需的营养物质;半胱氨酸含量高表明菌根真菌的固硫作用也很强;脯氨酸可以参与菌株细胞渗透胁迫,降低蛋白质水解产生的游离氨毒害,同时通过脯氨酸杂环积累,大量存储碳源和氮源,可用于逆境解除后为菌株恢复生长提供所需必要养分和呼吸基质,在自然生境营养贫乏的条件下,这3种氨基酸可以参与菌根真菌的重要生化途径,合成兰科植物种子萌发所需的必需氨基酸,对兰科植物种子萌发生长与提高抗逆性有积极作用（齐永青 等2003）。
2.4 其他矿质养分
兰科植物种子萌发需要从内生真菌中获取各种大量元素与微量元素,一些兰科植物成熟后根部粗糙,其生长依然需要内生真菌提供矿物质养分,尤其是磷元素（Baylis 1975）。菌根真菌能够通过基质外菌丝（extramatrical mycelium）吸收基质中的正磷酸盐（Cameron et al. 2007）等磷酸盐,并通过共生结构传递给兰科植物,与不接菌相比,兰科植物对磷的吸收速率可以提高100倍（Alexander et al. 1984）。
采用与碳流研究相似的分离培养系统研究发现,菌根真菌可以将32P标记的磷酸盐传递给D. purpurella原球茎（Smith 1966）。Richardson et al.（1992）将地生兰植物Platanthera hyperborea (L.) Lindl.的种子分别与兰科菌根真菌丝核菌Rhizoctonia cerealis E.P. Hoeven和角菌根菌Ceratorhiza goodyerae-repentis (Constantin and Dufour) R.T. Moore共培养,采用能量色散X射线谱（energy-dispersive spectroscopy）进行观察,结果表明侵入P. hyperborea原球茎的部分菌丝含有多磷酸盐体（polyphosphate bodies）,可以作为磷素养分被兰科植物吸收利用。
除了磷元素外,菌根真菌也可以为兰科植物种子提供其他多种矿物质养分。不同兰科植物种子共生真菌所含矿物质元素的种类与含量不尽相同,在7种能够促进兰科植物种子萌发的菌株代谢产物中,均检测到铁、镁、锂、锌、锶、钾、铜、铝、锰、钼、钡、钠、镍、钙、磷、铅、铬、硅等元素（郭顺星和徐锦堂 1990b）,有些元素含量甚微,但菌丝被胚细胞消化后,微量元素可以作为有机物合成或代谢中酶的催化剂,在种子萌发中发挥重要的作用（徐云 和于力文 1984;Bertolini et al. 2014）,而某种元素的缺乏则会影响种胚的生长以及幼苗的发育。
3 内生真菌为兰科植物种子萌发提供激素、维生素和抗生素
3.1 植物激素
内生真菌不仅可以为兰科植物种子提供碳、氮等养分物质,还可以提供其他一些涉及促进种子萌发、幼苗分化有关的次生代谢产物,如激素类、维生素类、抗生素类物质。
植物激素是一类很重要的信号传导分子,含量甚微,却对植物的生长发育具有显著生理调节作用。在个体发育中,不论是种子萌发、营养生长、繁殖器官形成以至整个成熟过程,植物激素都在各种水平上调控着植物的生命活动,例如玉米素核苷（zeatin riboside,ZR）、玉米素（zeatin,Z）等细胞分裂素可作用于胚胎发育、种子发育等过程（Pierce et al. 2015）;赤霉素（gibberellins,GAs）能够打破植物休眠,诱导有丝分裂开始,促进种子发芽,提高种子萌发率（Sun & Gubler 2004;Jiang & Fu 2007;Heirati et al. 2015）。有研究显示,虽然外源激素并不是金线莲Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.、铁皮石斛、杓兰等兰科药用植物种子萌发形成原球茎的必需条件,但外源激素的加入可以显著促进种子萌发,并进一步促进原球茎的增殖分化（邓莲等 2012;徐迎亚 2016）。
研究表明,不同植物激素之间还存在协同作用,在种子培养时可以单一添加也可以配合使用,单一添加某种激素时有限的促进效果则暗示了兰科植物种子萌发机制的复杂（Miyoshi & Mii 1995;Rodrigues et al. 2015）,而多种类型植物激素的配合使用往往能产生较为明显的促萌发作用。不过,不同植物激素之间也可能存在抑制作用,如GAs与ABA在种子萌发过程中会起到相反的作用,GAs能够促进种子萌发,而ABA则能够影响种子休眠的发生和维持,具有促进衰老、抑制生长的作用,会抑制种子萌发过程,两种激素含量比值的不同可以调节种子的萌发过程（Weiss & Ori 2007）。
菌根真菌能够代谢产生多种植物激素类物质,并可以分泌到胞外（李玉萍等 1988）。如密花石斛Dendrobium densiflorum Wall.菌根真菌镰孢菌体内和发酵液中均含有赤霉素类植物激素（吴静萍等 2002）。菌丝侵入到植物体内后被周围组织消化,可以使胞内激素释放出来,从而得到充分利用,避免在体外被破坏;而胞外激素则更容易被种子吸收利用,研究显示,胞外的生长素类植物激素吲哚丁酸对蝴蝶兰未成熟种子胚的发育以及原球茎的形态建成具有明显的促进作用（曹君迈等 2006）。
杓兰等一些兰科植物种子,如果采种时间太晚,种胚中就会形成一些萌发抑制物质,导致种子萌发困难,该抑制物质中可能包括植物激素ABA。于雪梅（2000）对8种金线莲促生真菌产生的植物激素进行分析,结果表明它们均有产生GA3、吲哚乙酸（indole-3-acetic acid,IAA）、Z和ZR的能力,且在8种供试菌根真菌中,其激素含量与对金线莲的促生效果成正相关,并在接菌的金线莲叶片中检测到了GA3、Z和ZR,其含量均高于不接菌的对照苗,不过也从菌丝体中检测到对植物生长有抑制作用和加速衰老的植物激素ABA;张集慧（1999）从促进兰科药用植物生长发育的5种内生真菌的发酵液和菌丝体中也分别鉴定到了GA3、IAA、ABA、Z、ZR等5种植物激素,其中也包括ABA。不过,除了上文提到的GAs,Steele（1996）认为细胞分裂素在杓兰种子萌发过程中也可以拮抗ABA的抑制作用,使种子脱离休眠状态,从而促进种子萌发。黄家林和胡虹（2001）的研究进一步证实,外源细胞分裂素促进杓兰种子萌发的机理除此之外,更重要的是可以作为一种萌发诱导物质直接起作用,明显促进种子萌发。
此外,植物激素还可以提高兰科植物种子的抗逆性。研究表明,在较低浓度氯化钠（NaCl）胁迫下,GA3处理对二月兰Orychophragmus violaceus (L.) O.E. Schulz种子萌发具有促进作用,且随着GA3浓度的增加,其促进作用增强,说明适宜浓度的GA3处理可以缓解NaCl胁迫对二月兰种子萌发的抑制作用（韩建秋2012）。
3.2 维生素
在兰科植物种子非共生萌发培养时,常在培养基中加入维生素B3（烟酸）、维生素H（生物素）、维生素B1（硫胺素）等物质,可以使种子萌发率显著提高,在种子保藏时加入适宜浓度的抗坏血酸则可以使种子与原球茎的萌发活力得到更长时期的保持（Sembi et al. 2017）。维生素类化合物在植物细胞内主要以各种辅酶的形式参与多项代谢活动,促进植物的生长与分化。在共生萌发时,菌根真菌同样能为兰科植物种子提供代谢产生的维生素类物质。
多项研究表明,兰科植物内生真菌可以代谢产生多种维生素类化合物。Cappelletti于1947年自兰科植物春兰的菌根真菌Corticium catonii Burg.纯培养液中多次分离得到维生素B1、维生素B1的前体物质PABA和烟酸;吴静萍等（2002）研究发现从福建密花石斛中分离得到的菌根真菌可以分泌维生素B2、B6、叶酸,其中维生素B6为植物体本身不能合成,但对种子萌发和幼苗的生长具有良好的促进作用,而维生素B2和叶酸虽为植物本身能合成,但作为辅酶,它们一样有利于兰科植物的正常生长;Harvais & Pekkala（1975）自兰科植物D. purpurella共生真菌的液体培养基中检测到,其含有33ppb的烟酸和（或）烟酰胺,以及1.5ppb维生素B1,采用最佳的培养条件,该真菌分泌到培养基中的烟酸含量甚至可以达到10mg/g干菌丝体;Hijner & Arditti（1973）研究发现,采用含有矿物质、糖类、硫胺素以及叶酸的培养基培养分离自兰属植物的丝核菌属真菌,可以明显地产生硫胺素结构的嘧啶部分,该部分可以促进某些兰科植物幼苗的生长,此外,该菌株同样可以代谢产生烟酸,从而促进兰科植物种子的生长发育。
有趣的是,兰科植物内生真菌可以独立合成B族维生素或其前体,或与兰科植物协作,各自合成前体,再由两者合成的前体共同合成B族维生素,满足菌根真菌和兰科植物对维生素的共同需要。例如,从Cymbidium中分离获得的丝核菌可以产生烟酸和维生素B1的嘧啶部分,而兰科植物可以产生合成维生素B9（叶酸）的前体物质对氨基苯甲酸,这表明兰科植物与菌根真菌合作完成维生素的合成,以满足二者生长发育的需要（Hijner & Arditti 1973）。兰科植物种子也可以产生并释放一种叶酸成分——对氨基苯甲酸,该成分能够满足共生真菌对维生素的需求,由此表明,兰科植物与其共生真菌的共同进化可能与维生素需求有关,两者之间的维生素或其他成分的营养交换是共生关系的重要体现。
3.3 抗生素
许多菌根真菌在纯培养过程中都能产生抗生素。研究表明,在无菌培养的条件下,为种子提供碳氮等营养物质,可使多数兰科植物种子顺利萌发,但将其幼苗从无菌条件移入自然界后成活率较低,且生长缓慢,而采用种子伴菌播种方法后,入侵兰科植物种子的菌根真菌不但能为种子提供萌发所需的营养物质,而且由于真菌含有抗生素类物质,可保护种子免遭杂菌侵害,提高种子的萌发率,并为种子的后生长提供良好的环境（郭顺星和徐锦堂 1991）。
郭顺星和徐锦堂（1990d）自3种兰科植物原球茎中分离得到6种能够促进兰科植物种子萌发的菌株,发现03、G3、G4号菌株的发酵液能够对细菌类的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn、大肠杆菌Escherichia coli (Migula) Castellani and Chalmers、藤黄八叠球菌Sarcina lutea (Schroeter) Cohn、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus Rosenbach以及真菌类的葡枝根霉Rhizopus stolonifer (Ehrenb.) Vuill.、立枯丝核菌R. solani等6种试验菌均具有较强的抑菌作用,04号菌与紫萁小菇Mycena osmundicola J.E. Lange.对枯草芽孢杆菌的抑制作用最强,表明不同真菌的次生代谢产物中含有不同类型与含量的抗菌素,可能作为兰科种子萌发的营养物质之一。张丽春和郭顺星（2009）从5种石斛的155种内生真菌中筛选得到48种真菌对至少1种供试菌株有抗菌活性,其中8株Fusarium属真菌为优势菌种,活性菌株中的14株具有较强的抗菌活性,进一步证实了药用植物内生真菌是一个有着广阔前景的潜在抗菌药物资源。
很多促进兰科种子萌发的内生真菌中均含有甾体类、萜类、黄酮类、醌类等多种类型成分。例如,石斛小菇代谢产物中含有麦角甾-7,22-双烯-3-羟基,6,9-氧桥-、β-谷甾醇（陈晓梅 1999）;瘤菌根菌属真菌AR18可以代谢产生麦角甾醇、麦角甾烯氧化物、麦角甾醇过氧化物、β-谷甾醇、豆甾醇等8种甾体类成分,还可以产生醌类成分大黄素甲醚以及黄酮类成分5,7-二羟基-6-甲氧基黄酮和5,6,7-三羟基黄酮（郭文娟 2007）。很多研究均显示,以麦角甾皖型骨架的甾体类成分具有良好的抗菌活性（张弘弛 2007）,郭文娟（2007）从蜜环菌中分离得到的麦角甾醇可以促进天麻种子的萌发并促进天麻原球茎的营养繁殖,可能其良好的抗菌能力是其促萌发作用的机制之一;柯春林等（2015）曾对黄酮类化合物潜在的抗菌活性及其机理进行综述,表明黄酮类成分具有良好的抗菌活性;已有研究表明醌类化合物大黄素甲醚对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等26种细菌均有抑制作用。此外,也有研究显示萜类及其皂苷（Duan et al. 2016）、有机酸类（May Zin et al. 2017）、环肽类（郭志勇等 2007）等也均为植物内生真菌中的抗菌成分类型。
4 内生真菌介导兰科植物种子萌发的其他因素
除上述提到的各种营养因素,还有研究发现内生真菌可以为兰科植物种子提供一些其他营养物质与因子促进萌发与生长。例如,在共生萌发过程中,内生真菌能够促进种子对自由水分子的吸收,从而提高萌发效率（Yoder et al. 2000）;有些种子和原球茎明显缺乏某些酶的功能,例如不能进行硫的代谢,而多数菌根真菌可以产生胞外酶,帮助兰科植物克服缺陷,完成完整的代谢过程。
菌根真菌代谢产生的蛋白质以及小分子物质也可能具有促进兰科植物种子萌发的活性。舒莹（2005）对小菇属真菌MF24促进铁皮石斛原球茎生长的活性因子进行分析,发现真菌诱导子中菌丝体和发酵液均有诱导作用,且以菌丝体为主;菌丝体中小分子化合物几乎没有诱导活性,而含蛋白的寡糖和蛋白能极显著地增加原球茎生物量的累积,含脂含蛋白的寡糖能够显著提高原球茎的增殖,表明MF24真菌诱导子促进铁皮石斛原球茎生长的活性因子主要是菌丝体的蛋白质和寡糖。而郭文娟（2007）则发现从蜜环菌中分离得到的单体化合物麦角甾醇也可以促进天麻种子的萌发与原球茎的营养繁殖。由此也再次表明,不同菌根真菌对不同兰科种子促进萌发与生长的活性因子不同。
此外,目前已经有大量真菌来源的诱导子被用于对植物的诱导作用研究。常用的真菌诱导子多是来自于真菌的外源性生物诱导子,是真菌的表面结构性成分及分泌的代谢物（Eilert 1987）,包括真菌的菌丝体、菌丝体降解产物、发酵液以及真菌分泌物质等。从化学结构上分类,真菌诱导子包括多糖、脱乙酰几丁质、几丁质、糖蛋白、短肽、不饱和脂肪酸等（Melchior & Kindl 1991）。将能够促进兰科植物种子萌发的菌根真菌制作为真菌诱导子加入培养基中,观察其对兰科种子的诱导作用,可以验证真菌代谢产物对种子的促萌发作用。有研究者以7种能够促兰科种子萌发的菌根真菌培养物的醇、水提取液培养细叶石斛种子,其发芽率可以达到40%-70%（郭顺星和徐锦堂 1990c）。在基础培养基中加入不同兰科菌根真菌的菌丝体提取物与代谢物,可以不同程度地促进兰科植物种子、愈伤组织、原球茎以及不定芽的生长,提高原球茎的鲜重和干重（高微微和郭顺星 2001）。菌根真菌促进兰科植物种子萌发的机制复杂,真菌诱导子的成功应用表明有些菌根真菌可以不通过侵入种子,而仅通过改变培养基质组成,为种子提供所需的营养物质,促进兰科植物种子萌发。
5 结论与展望
本文对内生真菌为兰科药用植物种子提供的营养物质进行综述。内生真菌不仅可以通过营养传递过程为兰科植物种子提供萌发所需的碳源、氮源以及矿物质等养分,还可以合成植物激素与维生素来调节种子萌发过程,并通过代谢产生的抗生素为种子共生萌发与生长创造良好的环境。菌根真菌代谢产生的一些小分子物质和蛋白等成分也可以促进兰科植物种子的萌发。不过目前的兰科植物种子共生萌发研究仍存在诸多问题值得深入探讨：（1）目前对不同种属兰科菌根真菌的初生与次生代谢产物研究不够透彻,能够促进兰科药用植物种子萌发的活性因子有待进一步深入挖掘与分析;（2）内生真菌促进兰科植物种子萌发的分子机制研究较少,且代谢产生单一物质的促萌发机制研究相对较浅,亟需分子与基因功能等方面的机理研究;（3）自然条件下,同一兰科植物菌根中可能含有不同种属的菌根真菌,有研究表明多种菌根真菌之间可能存在协同作用,因此对于兰科植物种子萌发,也同样需要研究菌根真菌的多菌协同促萌发作用。
（本文责编：韩丽）
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网址: 内生真菌对兰科药用植物种子萌发作用研究进展 https://m.huajiangbk.com/newsview670379.html
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