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Application of single base editing technique in pig genetic improvement: a review

花匠小妙招
2024-11-23 09:57

赵无迪, 黄国斌, 朱向星, 毕延震, 唐冬生. 碱基编辑技术在猪遗传改良中的应用研究进展[J]. 生物工程学报, 2023, 39(10): 3936-3947.

ZHAO Wudi, HUANG Guobin, ZHU Xiangxing, BI Yanzhen, TANG Dongsheng. Application of single base editing technique in pig genetic improvement: a review[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(10): 3936-3947.

碱基编辑技术在猪遗传改良中的应用研究进展

, 黄国斌1 , 朱向星2 , 毕延震3 , 唐冬生1,2

1. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院广东省动物分子设计与精准育种重点实验室, 广东佛山 528225;
2. 佛山科学技术学院医学院广东省基因编辑工程技术研究中心, 广东佛山 528225;
3. 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程与分子育种湖北省重点实验室, 湖北武汉 430072

收稿日期：2023-04-17；接收日期：2023-07-03；网络出版时间：2023-07-10

基金项目：国家重点研发计划(2021YFA0805900)；广东省重点领域研发计划-重大科技专项(2022B0202110002，2018B020203003)；国家自然科学基金(82070199)；广东省普通高校重点领域专项(2021ZDZX2050)

摘要：猪传统育种周期长、耗资大，亟需利用新技术振兴种业。近年来兴起的CRISPR/Cas9基因编辑技术在猪遗传改良上表现出巨大潜力，成为研究的热点。单碱基编辑是在CRISPR/Cas9系统基础上发展起来的新型碱基编辑技术，可对单个碱基进行靶向突变。CRISPR/Cas9技术容易操作且设计简单，但该技术会导致DNA双链断裂，使基因结构不稳定，造成基因的随机插入和缺失，故而大大制约了该技术的应用。与CRISPR/Cas9技术不同，单碱基编辑技术不产生双链断裂，因而具有更高的基因编辑精准性和安全性，预期在猪遗传育种应用上具有显著优势。本文综述了CRISPR/Cas9技术的工作原理与不足、单碱基编辑的开发与优势、不同碱基编辑器的原理、应用特点及其在猪遗传改良上的应用，以期对后续开展猪的基因编辑遗传育种实践提供理论参考。

关键词：CRISPR/Cas9 基因编辑单碱基编辑猪遗传改良

Application of single base editing technique in pig genetic improvement: a review

ZHAO Wudi1 , HUANG Guobin1 , ZHU Xiangxing2 , BI Yanzhen3 , TANG Dongsheng1,2

1. Guangdong Key Laboratory of Animal Molecular Design and Precise Breeding, School of Life Science and Engineering, Foshan University, Foshan 528225, Guangdong, China;
2. Guangdong Research Center of Gene Editing Engineering Technology, School of Medicine, Foshan University, Foshan 528225, Guangdong, China;
3. Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding, Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science, Hubei Academy of Agricultural Sciences, Wuhan 430072, Hubei, China

Received: April 17, 2023; Accepted: July 3, 2023; Published: July 10, 2023

Supported by: This work was supported by the National Key Research and Development Program of China (2021YFA0805900), the Research and Development Plan for Key Fields of Guangdong Province-Major Science and Technology Project (2022B0202110002, 2018B020203003), the National Natural Science Foundation of China (82070199), and the Special Project in Key Fields of Universities in Guangdong Province (2021ZDZX2050)

Abstract: Traditional pig breeding has a long cycle and high cost, and there is an urgent need to use new technologies to revitalize the pig breeding industry. The recently emerged CRISPR/Cas9 genome editing technique shows great potential in pig genetic improvement, and has since become a research hotspot. Base editor is a new base editing technology developed based on the CRISPR/Cas9 system, which can achieve targeted mutation of a single base. CRISPR/Cas9 technology is easy to operate and simple to design, but it can lead to DNA double strand breaks, unstable gene structures, and random insertion and deletion of genes, which greatly restricts the application of this technique. Different from CRISPR/Cas9 technique, the single base editing technique does not produce double strand breaks. Therefore, it has higher accuracy and safety for genome editing, and is expected to advance the pig genetic breeding applications. This review summarized the working principle and shortcomings of CRISPR/Cas9 technique, the development and advantages of single base editing, the principles and application characteristics of different base editors and their applications in pig genetic improvement, with the aim to facilitate genome editing-assisted genetic breeding of pig.

Keywords: CRISPR/Cas9 gene editing single base editing pig genetic improvement

中国是世界第一大生猪生产和消费国，猪肉是中国居民最主要的肉类消费品[1]。近年来生猪产业的规模、生产能力以及质量安全水平得到显著提升，已经在农业乃至国民经济中占有重要地位。然而在取得突出成绩的同时，也面临着巨大挑战，我国生猪良种基本自给，核心种源还需要进口，严重限制了我国生猪产业高质量发展[2]。猪传统遗传改良存在周期长、耗资大、进展缓慢等现实问题，亟需利用新技术振兴猪种业，从而保障我国生猪产业利益和国家食品安全。

与传统遗传改良相比，近年来兴起的以CRISPR/Cas9系统为代表的基因编辑技术具有显著优势，仅需1个世代就可改变猪的1个或多个可遗传性状，极大地提高了遗传改良效率，是当前国内外生猪育种领域的研究热点[3]。利用CRISPR/Cas9技术，能够快速提升猪的生长速度、瘦肉率和抗病性等，显著提升经济效益。与此同时，基于CRISPR/Cas9衍生出的单碱基编辑(base editor, BE)技术，能够克服CRISPR/Cas9因导致基因组双链断裂(double strand breaks, DSB)引发的基因脱靶、染色体不稳等技术局限，实现更安全、更精准的基因组修改，因而在生猪遗传改良上具有更好的应用前景[4]。

本文从CRISPR/Cas9系统的工作原理和不足出发，阐述了单碱基基因编辑技术的开发过程和技术优势，着重就单碱基基因编辑技术在猪遗传改良上的最新应用进行综述，以期为后续开展猪的基因编辑改良工作提供参考和借鉴。

1 CRISPR/Cas9系统工作原理及其不足

CRISPR/Cas9由Cas9蛋白和单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)组成，当sgRNA与能够发生互补配对的基因组靶点识别结合时，激活Cas9蛋白的DNA内切酶活性，将基因组切割产生DSB，并激活细胞内的DNA修复机制，然后通过非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)或同源重组(homologous recombination, HR)机制分别实现基因突变或基因敲入[5-6]。

与传统的基因修饰技术相比，CRISPR/Cas9技术具有组装便捷、剪切高效以及特异性强等优势，因而被迅速用于动植物的基因改造，也被用于猪遗传改良[7-8]。但深入研究表明，CRISPR/Cas9存在诸多局限，原因在于该系统的活性窗口宽，导致编辑时常发生旁观者效应降低编辑准确性[9]；Cas9识别的靶序列受前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)序列的制约，致使基因组中可编辑位点的数量较少[9]。与此同时，CRISPR/Cas9诱发的非同源末端连接(nonhomologous end-joining, NHEJ)修复机制存在不可控性，插入和删除的碱基数无法得到控制，易发生脱靶、基因组大范围删除、基因组重排等，引起安全风险。此外，有时可能无法成功对目的基因产生理想的敲除效果，在筛选有效突变体时筛选效率也很低[10-12]。正是由于其存在的基因编辑欠精准性和安全风险，因而在一定程度上限制其在家畜基因改良中的应用。

2 单碱基编辑技术工作原理及其优势

单碱基编辑技术是在CRISPR/Cas9技术基础上发展起来的新一代基因编辑技术，具有特异性强、高效、安全以及副产物少等优势，有效改善了CRISPR/Cas9的弊端。单碱基编辑器主要由碱基脱氨酶、Cas9变体以及sgRNA三部分组成。其中碱基脱氨酶负责对碱基进行脱氨基，Cas9变体负责结合DNA靶位点不切割或仅切割一条DNA链，sgRNA引导Cas9蛋白与碱基脱氨酶形成的复合物靶向目标碱基序列[13-14]，共同完成改造目标基因的目的。目前较成熟的单碱基编辑器有4种，分别是：胞嘧啶碱基编辑器(cytosin base editor, CBE)[15]、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor, ABE)[16]、糖基化酶碱基编辑器(glycosylase base editor, GBE)[17]和双碱基编辑器(dual base editor, DBE)[18](图 1)。

图 1 CRISPR/Cas9基因编辑与碱基编辑工作原理Fig. 1 Mechanisms of CRISPR/Cas9 gene editing and base editing. 基因靶点在CRISPR/Cas9作用下产生双链断裂，并在NHEJ机制下发生随机碱基插入或缺失突变，而在碱基编辑作用下，在不引发双链断裂的同时，实现碱基转换突变. 因而编辑结果更精准、可预测，也避免了因DSB引发的安全隐患 Gene targets undergo double-strand breaks in response to CRISPR/Cas9 and random base indel or deletion mutations in response to NHEJ mechanisms. Under the action of base editing, the mutation of base conversion can be achieved without causing double strand break. Therefore, the editing results are more accurate and predictable, and the security risks caused by DSB are avoided.

2.1 胞嘧啶碱基编辑技术

胞嘧啶碱基编辑器主要由胞嘧啶脱氨酶、无切割活性的Cas9蛋白(dead Cas9, dCas9)以及sgRNA组成。其中的sgRNA引导dCas9与胞嘧啶脱氨酶靶向目标序列，胞嘧啶脱氨酶引起胞嘧啶(C)脱氨形成尿嘧啶(U)，尿嘧啶(U)与腺嘌呤(A)相配对，在DNA链中腺嘌呤(A)又与胸腺嘧啶(T)配对，最终实现单碱基C到T (G到A)的编辑[19]。CBE最早由Komor等[20]于2016年开发，他们使用鼠源脱氨酶APOBEC1 (rAPOBEC1)经XTEN与dCas9的C端相连接，构成了第1代胞嘧啶碱基编辑器BE1。但尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil DNA glycosylase, UDG)会识别初始编辑导致U: G错配，启动碱基的切除修复机制，切除U，修复到C: G的初始状态，因此碱编辑效率(仅在0.8%−7.7%左右)较低[21]。为防止突变的U碱基变回C，Komor等在BE1系统的C端连接一段尿嘧啶DNA-糖基化酶抑制蛋白(uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI)，构成BE2[20]。相关细胞实验表明，BE2的编辑效率得到了显著提升，是BE1的3倍，编辑效率最高可达到20%[22]。BE1和BE2所用的变体Cas9蛋白都为无切割活性的dCas9蛋白，不会切割双链。因此，几乎不会引入插入和缺失，产生双链断裂的比例低于0.1%。为了进一步提高碱基的编辑效率，将尿嘧啶DNA糖苷酶抑制因子UGI融合到BE1的碳端，并用核酸酶失活的Cas9蛋白(Cas9 nickase, Cas9n)取代BE1、BE2中的dCas9，形成BE3，其编辑效率提高到40%，且广泛应用于生物领域[23-24]。

进一步的研究发现，在DNA复制和错配修复过程中，尿嘧啶U易被UDG识别并切除[18]。为进一步抑制UDG的活性，2017年Komor等在BE3的Cas9序列C端附加1个额外的UGI拷贝，并延长了rAPOBEC1与Cas9n之间的距离以及Cas9n和UGI之间的接头，这便形成了BE4[25]。在碱基编辑过程中会出现碱基颠换即出现C到G、C到A的副产物。BE4在不影响编辑活性的情况下，有效降低了碱基颠换的频率，提高目标产物纯度。2018年Koblan等在BE4主要蛋白rAPOBEC1-Cas9的N端、C端分别添加了定位信号，再将绿色荧光蛋白基因GFP和2A肽基因P2A序列连接在rAPOBEC1-Cas9的C端，接着优化密码子最后得到BE4max，较BE4提升了1.3倍[26]。

2.2 腺嘌呤碱基编辑技术

基于CBE技术原理，将腺嘌呤脱氨酶与dCas9相融合从而制备出腺嘌呤碱基编辑器。相较于CBE，ABE将胞嘧啶脱氨酶替换为腺嘌呤脱氨酶，此过程中无需UGI作用。ABE的工作原理是：ABE靶向链窗口内腺嘌呤(A)，在腺嘌呤脱氨酶水解情况下产生的肌苷(I)，在DNA复制或读取过程被识别为鸟嘌呤(G)，指导非靶标链切除原配对的胸腺嘧啶(T)并替换为转化为胞嘧啶(C)，因此编辑过的靶点在经过一轮DNA复制后最终实现A: T碱基对到G: C碱基对的转换。

自然界中存在的腺嘌呤脱氨酶只能在游离腺嘌呤、腺苷以及RNA中的腺苷或RNA-DNA异源双链中脱氨，无法作用于DNA链上的腺嘌呤[27]。开发出能作用于DNA链上的腺嘌呤脱氨酶是开发ABE碱基编辑技术的重中之重。早期研究表明，大肠杆菌(Escherichia coli) RNA腺苷脱氨酶TadA不需要小分子激活，且可以作用于多核苷酸，遂引起关注。2017年Gaudelli等对野生型TadA进行人工驯化，经过7轮改造后成功开发出了能够作用于单链DNA的ABE系统ABE7.10[16]。为了改进ABE7.10的效率和准确性，2018年Koblan等在TadA7.10的N端增加bpNLS，通过优化密码子序列的方式设计出编辑效率更高的ABEmax[26]。2020年Richter等在ABE7.10的基础上增加8个新突变位点的突变体TadA8e，开发出脱氨效率及与Cas蛋白的兼容性均大幅提高的ABE8e，经超高分辨率冷冻电镜对ABE8e结构进行分析，发现其脱氨速度是ABE7.10的590倍，超快的脱氨速度显著提升了ABE的编辑活性[28-29]。此外，由于在细胞中暂未发现能够快速切除腺嘌呤脱氨形成的次黄嘌呤碱基(I)的酶，因此一旦A脱氨后生成的I后将直接被当成G读取，无法形成无嘌呤无嘧啶状态，因此该碱基编辑器编辑的副产物极少，可进行高纯度碱基定向编辑。

2.3 糖基化酶碱基编辑技术

由于脱氨酶的功能在于碱基的脱氨基，因而ABE和CBE分别仅能实现嘌呤和嘧啶内的转换，而要实现跨嘌呤和嘧啶间的转换(亦称“颠换”)则需要借助新的工具。新工具GBE的发现得益于对CBE编辑副产物的深入探究，其主要原理是将CBE系统中的UGI替换为尿嘧啶-DNA糖基化酶(uracil-n-glycosylase, UNG)，UNG能够水解断裂渗入DNA中的尿嘧啶糖苷键，通过生成无碱基中间体介导C到G/A的颠换[17]。2021年Zhao等开发了在大肠杆菌中实现C-A颠换的AID-ncas-Ung (GBE)和在哺乳动物细胞中实现C-G颠换的APOBEC-nCas9-Ung[17]。同年，Koblan等也开发出了与CBE作用相接近、可以实现碱基颠换的碱基编辑器CGBE1 (C-to-G base editors)。为确定C·G至G·C编辑结果的影响因素，开发了深度学习模型，可以有效预测CGBE编辑结果，实现了高效有针对性的碱基颠换预测[30]。不久后Kurt等开发了两种可实现碱基颠换的碱基编辑器[31]。第1种在BE4max系统上进行改造而得到的，由nCas9、rAPOBEC1 (R33A)及大肠杆菌尿嘧啶DNA N-糖基化酶eUNG组成。将2个UGI删除，同时增加eUNG，解除UGI对UDG的抑制作用，以期获得更高的C到A或C到G颠换的概率。第2种是在CGBE1上进行改造，去除CGBE1上的eUNG构成miniCGBE1也具备相当的编辑效率(与CGBE1相比略有下降)，但产生双链断裂的概率明显低于CGBE1。这2种碱基编辑器均可实现目标序列C-G碱基颠换，降低非目标C到A、C、T以及双链断裂的产生。与此同时，Yuan等还对密码子进行优化，改变脱氨酶种类开发了OPTI-CGBEs[32]。目前GBE碱基编辑系统也在白杨(Populus alba)、水稻(Oryza sativa L.)等植物的碱基编辑中发挥很大作用。GBE是第1个可在哺乳动物上进行C-G特异性转换的碱基编辑器，具有较高的特异性和较窄的编辑窗口，为3 000多种已知的C、G碱基突变引起的人类遗传疾病治疗带来了曙光。

2.4 双碱基编辑技术

前述ABE/CBE和GBE的作用靶标为单种碱基，分别由相应的脱氨酶催化单一类型的核苷酸进行转换，应用覆盖范围低。为了能够同时靶向两种碱基转换，2020年高彩霞等开发了双重碱基编辑器——饱和靶向内源基因突变碱基编辑器(saturated argeted endogenous mutagenesis editors, STEME)，将胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶两种脱氨酶依次与nCas9的N端相融合，并在nCas9的C端融合1个或2个UGI拷贝，可在单个sgRNA的引导下诱导相关靶点，同时完成C到T、A到G的突变，揭开了双碱基基因编辑器的研究序幕[33]。其中C-T的编辑效率与CBE相似，A-G编辑效率相对略有降低，但是DBE总体效率却大于ABE+CBE系统[34]。与此同时，Zhang等将胞嘧啶脱氨酶rAPOBEC1用突变活性更高的hAID替换，并将NLS密码子、UGI串联优化进行调整，获得了A & C-BEmax双碱基编辑器[35]。不久后，Sakata等将CBE系统Target-AID和体量更小的miniABEmaxV82G的脱氨酶分别融合到nCas9的N端和C端，并增加2个UGI拷贝，构建了一种新的双碱基编辑器(synchronous programmable adenine and cytosine editor, SPACE)[18]。Target-ACE双碱基编辑与原有的单碱基编辑效率相差不大，但SPACE则具有更高的双碱基编辑活性。双碱基编辑系统的成功开发，克服了同时采用CBE、ABE系统编辑效率低的问题，在遗传育种、疾病治疗等方面都有很大的应用潜力。

3 单碱基编辑技术在猪性状改良上的应用

我国地方猪肉质细嫩、口感好，但瘦肉率低、生长缓慢[36]。传统的改良方法所需时间长、改良方向不可控、效率低会耗费大量的人力、财力。基因编辑技术的兴起，将显著加快猪的遗传改良进展。近几年我国科技工作者采用基因编辑技术提高了猪的瘦肉率、加快猪生长速度以及增强抗病性等，为我国地方猪品种改良提供了新途径[37-39]。目前基因编辑技术已发展到第4代。分别是锌指核酸酶(zincfinger nucleases, ZFNs)技术、转录激活效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)技术、CRISPR/Cas系统以及最新的单碱基编辑技术[40-42]。前3代均通过人工核酸酶作用于特定基因组位置，使其断裂产生DSB，诱导DNA进行修复，从而实现遗传突变。正因为DSB的产生，将引发基因脱靶、染色体不稳，甚至激活癌基因等潜在风险[43-45]，引发了学者对生物安全方面的思考。第4代单碱基编辑技术由于不产生DSB，仅针对单个碱基进行转换，提高了基因编辑的准确性和效率，同时降低了生物安全风险，为种猪遗传改良提供了强大工具。

3.1 提高瘦肉率

肌肉抑制素(myostatin, MSTN)是对肌肉生长具有负调控的生长抑制素基因，又称生长分化因子8[46]。敲除后可促进肌肉生长，提高瘦肉率，MSTN基因主要在骨骼肌中表达。比利时蓝牛中双肌肉臀部的发育表型就是MSTN中功能缺失所造成的[47]。ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9介导的碱基编辑方法在兔子、奶牛、羊等动物中成功复制了双肌臀表型。证明了敲除MSTN可以显著提高动物的瘦肉率，从而改良其生长性状。

2020年Li等对两广小花猪MSTN信号肽基因序列进行定点突变(PVD20H和GP19del)，使MSTN基因表达显著下降[37]。结果表明，基因编辑猪的肌纤维数量有所增加，说明对MSTN相应区域进行精准编辑可有效促进猪肌肉生成。随着单碱基技术的发展。有望使用更准确高效、更加安全的编辑技术对猪的MSTN基因进行修饰。

2021年Pan等使用改良的CBE编辑器Y1-BE4max-NG对巴马香猪进行基因编辑。通过修饰MSTN基因的第20号氨基酸对应的TGG密码子使其变为终止密码子TAG、TGA或TAA，提前终止转录，从而使MSTN丧失活性[48]。2022年王晶等使用含有红色荧光的碱基编辑器YE1-BE3-FNLS在宁乡猪MSTN基因的第2个外显子处进行定点突变，成功引入了终止密码子TAA，使翻译提前终止，Western blotting结果显示，该基因蛋白表达量降低了60%[49]。

3.2 加快生长速度

胰岛素样生长因子2 (insulin like growth factor 2, IGF2)可以影响细胞增殖，也可以影响脂肪沉积及骨骼肌生长。若猪IGF2第3个内含子处存在突变，可提高IGF2的基因表达，从而提高瘦肉产量[50-51]。2020年王彦芳等用rA1-BE3以及优化后的hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F这4种不同的胞嘧啶碱基编辑器对猪成纤维细胞中IGF2基因第3个内含子进行定点突变[52]。最终结果表明，新开发的3种hA3A-BE3碱基编辑器效率远高于rA1-BE3。受脱氨酶活性影响，hA3A-BE3-Y130F、hA3A-eBE- Y130F的编辑效果相较于hA3A-BE3有所下降，但活性窗口相对缩小，降低了旁观者效应，有利于更加精准编辑。进一步说明了单碱基编辑技术在IGF2基因上的可能性。后期有望结合体细胞核移植技术来制备IGF2基因编辑猪，以获得生长速度更快的猪。2022年Song等利用hA3A-BE3- Y103碱基编辑器获得了CD163、MSTN、IGF2三基因同时突变的基因编辑猪。在靶位点上对C-T进行精准修饰使CD163、MSTN基因不表达，IGF2基因表达增加，使该猪在可以抵抗蓝耳病毒的同时提升瘦肉率[53]。为培育出既能改善生长性状又能使传染病抵抗力增加的多基因编辑猪构建良好宏图。

在哺乳动物中，脂肪沉积与三酰基甘油合成速率相关，该合成过程中受二酰甘油酰基转移酶1 (diacylglycerol-O-acyltransferase homolog 1, DGAT1)和二酰甘油酰基转移酶2 (diacylglycerol-O- acyltransferase homolog 2, DGAT2)基因的影响。2016年Zang等报道发现猪DGAT2基因极有可能比DGAT1发挥更重要的作用，影响猪背膘和瘦肉率[38]。黑素皮质素4受体(melanocortin 4 receptor, MC4R)类属于黑素皮质素受体家族。MC4R编码332个氨基酸被作为影响猪生长发育的候选基因，MC4R在动物体内起调节食欲和能量代谢的作用，具有较高的生产应用价值[54]。Vaisse等[55]、Geller等[56]和Young等[57]均发现该基因的移码突变和错义突变都可以影响猪背膘厚度、采食量和生长速度，是影响猪生长发育的重要基因之一。DGAT2和M4CR可作为后续单碱基编辑操作基因，进一步高效安全地改善猪的生长状态。

3.3 增强抗病性

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又称为猪蓝耳病，源于发病症状为猪双耳充血呈深蓝紫色。该病是由PRRS病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染引起，该病毒可入侵猪肺泡巨噬细胞或单核细胞，通过患病猪、空气、精液等途径快速传播，引起母猪发热、呼吸困难同时伴随流产的症状，且仔猪死亡率较高[58]。PRRSV易感范围大、传染性强，是当前我国生猪养殖业危害最大的传染病之一[59-60]，对该病的防控十分重要。

PRRSV入侵机体后与受体CD163相结合，敲除CD163受体蛋白或功能域可避免PRRSV的感染，有效防止该病的发生。2016年Whitworth等利用CRISPR/Cas9技术，成功构建出CD163第7个外显子缺失的基因编辑猪[39]。攻毒实验表明，CD163缺失的基因编辑猪有效抵抗了PRRSV感染，充分证明了CD163是该病毒入侵宿主的必需受体。2020年Wang等用改良的hA3A-BE3-NG成功地制备了CD163蛋白缺失猪细胞[61]。2022年赵为民等在胚胎水平上用YE1-BE3-FNLS系统将第7个外显子中的1个密码子CAA改变为终止密码子TAA，使其提前结束翻译[62]。相较于传统的CRISPR/Cas9技术的编辑方法，该研究的编辑效率可达到60%，编辑效率有所提高且碱基突变类型单一，改善了不易获得纯合CD163的基因敲除猪的弊端。

除了PRRSV以外，传染性胃肠炎病毒(transmissible gastro enteritis virus, TGEV)也是一种高度传染性疾病。已有相关报道证明了小肠上皮细胞上的pAPN是TGEV感染的关键受体[63]。2020年Xu等利用基因编辑技术成功制备了CD163和pAPN双基因敲除猪[2]。后续有望采用单碱基编辑技术来开发安全性更高的双基因敲除猪，成功抵抗PRRSV和TGEV的感染。

4 展望

GBE是对CBE的副产物进一步开发所得到的，但ABE副产物较少，后续可通过蛋白工程技术对不同蛋白作用进行解析，再筛选出合适的蛋白体，结合到ABE碱基编辑器，开发出A到C或A到T的碱基编辑器，为性状改良乃至基因治疗提供更强大的技术支撑。

单碱基编辑自问世以来，便以准确、便捷高效和安全等优势，被广泛应用于猪性状改良和遗传育种等相关领域。但由于脱靶效应的产生，这很大程度限制了其应用。大量研究表明，对脱氨酶进行改造，降低脱氨酶活性，可以有效减少随机产生的脱靶效应。因此如何在不降低编辑效率的同时降低脱靶率，提高安全性是未来的一个研究方向。现阶段的单基因编辑往往会受到PAM序列的制约。若设计出对PAM序列依赖性小或不依赖PAM的碱基编辑器，将会大大提升单碱基编辑器适用范围。单碱基编辑，仅在极少数基因的敲除上发展较为成熟，被确定可操作的基因少。可结合人工智能建立庞大的数据库，优化物理预测模型和映射模型降低脱靶率来提高基因编辑的准确性和安全性。随着世界各研究团队的不断探索，更深层的机制逐渐被挖掘，存在的许多问题也在逐步被完善。新型碱基编辑技术的不断开发与优化，进一步巩固了生物技术的底层技术能力，在生物产业中发挥更重要的作用。

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