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桐花树根际真菌的分离和鉴定

花匠小妙招
2024-11-23 10:42

桐花树根际真菌的分离和鉴定
Isolation and Identification of Rhizosphere Fungi from Aegiceras corniculatum

1. 引言

红树林生态系统是一个具有巨大潜在力的生物资源库，是世界上典型的海陆两栖生态系统，具有净化水质、防风消浪、固岸护堤、促淤保滩、丰富物种多样性等生态价值，具有极大的生态意义、药用价值和经济价值 [1]。桐花树(Aegiceras Corniculatum (L.) Blanco)为紫金牛科蜡烛果属真红树植物，是一种灌木或乔木，广泛分布于海南、福建、广东、广西、浙江、香港、澳门等地，生态作用最重要的关键物种，在近海生态安全与可持续发展方面起着重要的保障作用 [2]。桐花树因其特殊的生长环境，其化学成分和生理活性方面都具有很多特殊性。有研究显示，桐花树叶片中含有17种氨基酸，其中7种为人体必需氨基酸，还含有15种微量元素、8种挥发油化合物、10种脂肪酸，使其具有较多的药理活性 [3]。桐花树湿地系统主要通过物理作用、化学作用及生物作用对各种污染物加以吸收、积累而起到净化作用，尤其对降低重金属污染有非常重要的意义。从红树林植物桐花树等6种植物中分离到35株具有抗细菌活性的内生真菌，这无疑对桐花树林病害防治具有重要理论与现实意义 [4]。

近年来，由于人类对红树林资源的认识不足，把大量的红树林资源改造利用，使得红树林生态系统的平衡受到一定程度的破坏，红树林的病害和虫害也日益严重，已成为威胁红树林生存的主要因素之一 [5]。在红树林植物群落中，有着丰富而独特的真菌资源，它们参与有机物质的分解和无机营养物的再生，能降解海洋环境中的污染物和促进海洋自净，在海洋生态系统中起着重要作用。由于生态系统的改变，红树林真菌的生态功能也发生了变化，一些非致病性真菌对红树发生了侵染性，导致了病害的发生 [6]。因此，很有必要对红树区系的真菌组成结构进行研究，为桐花树真菌性病害的发生及早做出判断。

2. 材料和方法

2.1. 采样

采样地为广东省湛江市高桥红树林保护区(109˚45'23.64E, 21˚34'09.91N)。分别设置春(3月份)、夏(7月)、冬(11月) 3次采样，用铲子采集根际(根部0~1 cm范围内)土壤样品，装入密封采样袋中，带回实验室，置于4℃的冰箱内保藏待用。

2.2. 真菌分离

2.2.1. 培养基

孟加拉红培养基(Rose Bengal Agar)：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁(MgSO4∙7H2O) 0.5 g，琼脂20 g，1/3000孟加拉红溶液100 mL，蒸馏水1000 mL，氯霉素0.1 g。

制作过程：上述各成分加入蒸馏水中溶解后，再加孟加拉红溶液。加入培养基中，分装后，121℃灭菌20 min。倾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。

PDA培养基：琼脂20 g、葡萄糖20 g、马铃薯200 g、蒸馏水1000 mL。

制作过程：将马铃薯去皮，然后称取200 g切成小块，放入锅中，加海水1000 mL，加热煮沸，持续20 min，煮至马铃薯熟而不烂。趁热用两层纱布在量杯上过滤，取滤液，补充海水至1000 mL。将滤液倒入锅中加热，并加入葡萄糖，一边搅拌一边加琼脂粉，待琼脂粉20 g完全溶解后，将煮好的培养基分装入锥形瓶中，塞上塞子，瓶口用报纸紧紧包住，放入高压蒸汽灭菌锅中灭菌30 min。

2.2.2. 分离

采用稀释涂布法对样品进行分离。称取土壤样品1 g加入到pH为8.46的99 mL土壤样品中，充分混匀后将制成10−2、10−3和10−4土壤稀释液。分别吸取各稀释液100 μL，放入孟加拉红培养基(Rose Bengal Agar)平板中，涂布，盖好，用保鲜膜封口，然后置于28℃恒温培养箱培养5~7天。记录菌落数，并对单菌落用PDA进行分离纯化。

2.3. 菌株的鉴定

将纯化菌株接入PDA培养基中，28℃培养3~5天，肉眼观察菌株菌落特征、用尼康显微DS-Ri2进行产孢结构以及分生孢子等形态特征的观察及拍照，并进行分析。参考《真菌鉴定手册》 [7] 和《半知菌分属图册》 [8] 进行归属鉴定。

3. 结果与分析

3.1. 不同时期分离真菌菌落数

试验结果表明，从桐花树根际土壤样品中3次采样分离纯化共得到了54株真菌，并分别编号。其中以春季分离得到的菌落数最多有22株，其次是夏季有20株，最少的是冬季有12株。土壤样品的稀释度为10−2可以获得较高的菌落数，10−4的基本分不到菌(见表1)。

采样时间

10−2

10−3

10−4

总数

菌株编号

春

A1.1; A1.2; A1.3; A1.4; A1.5; A3.1; A3.2; A3.3; A3.4; A3.5; A4.1; A4.2; A5.1; A5.2; A5.3; A5.4; A5.5; A5.6; A6.1; A6.2; A6.3; A6.4

夏

B1.1; B1.2; B1.3; B1.4; B2.1; B2.2; B2.3; B3.1; B3.2; B3.3; B4.1; B4.2; B4.3; B4.4; B4.5; B5.1; B6.1; B6.2; B7.1; B7.2

冬

C1.1; C1.2; C1.3; C2.1; C2.2; C2.3; C3.1; C3.2; C3.3; C4.1; C5.1; C6.1

Table 1. Number and strain number of fungal colonies in rhizosphere soil of A. corniculatum at different periods

表1. 不同时期桐花树根际土壤真菌菌落数及菌株编号

经过分析，分离的54株真菌中，有28株为曲霉属Aspergillus，第一优势菌株，占了此次实验所分离得到的总菌株数的53.7%；18株菌株为枝顶孢霉属Acremonium，是第二优势菌群，占所分离到总菌株数的16.7%；8株菌株为青霉属Penicillium，占所分离得到的总菌株数的14.8%；还有3株菌株为枝孢霉属Cladosporium，占所分离得到的总菌株数的5.6% (见表2)。

3.2. 菌株的形态鉴定

3.2.1. 曲霉属Aspergillus

PDA培养基培养，3~4天长满整个培养基，菌落呈绒状、絮状或者毡状，黑色，菌丝有横隔，分生孢子梗不分枝，其顶端膨大成圆形、椭圆形或者棍棒状。在顶囊表面呈辐射状长满一层小梗，瓶状。瓶状小梗顶端产生成串的球形分生孢子。分生孢子梗生长在足细胞上(见图1)。

Figure 1. Strain A5.2 colony and morphology of aspergillus. (a) Colony; (b) Conidiophore and conidia; (c) Basal part; Bar = 10 μm

图1. 菌株A5.2曲霉的菌落形态以及显微形态。(a) 菌落形态；(b) 分生孢子和分生孢子梗；(c) 足细胞；标尺 = 10 μm

3.2.2. 枝顶孢霉Acremonium

PDA培养基培养，一个星期长满整个培养基，菌落平铺于培养基表面，白色絮状，4天后表面粉末状明显，之后菌丝逐渐平粘于培养基表面。分生孢子梗无色，光滑，基部宽，1~2个隔膜，向顶渐尖，孢子大小为15.7 μm，在菌丝顶端着生一团孢子，在菌丝的分枝处或非枝条顶端没有孢子簇(见图2)。

3.2.3. 青霉属Penicillium

PDA培养基培养，3天长满整个培养皿，菌落呈绒状、絮状、绳状、束状等不同的形态，青绿色，成熟后菌落表面呈粉末状。青霉的菌丝体产生长而直的分生孢子梗，上半部分产生对称或者不对称的扫帚状分枝，着生几轮小梗，小梗顶端着生成串的球形至卵形的绿色分生孢子(见图3)。

3.2.4. 侧齿霉属Engyodontium

PDA培养基培养，15天长满整个培养基，菌落多为洁白色，绒状、棉絮状。成熟后的菌落有些表面带有小滴液珠，孢子为圆形、镰刀形等，孢子梗既有对生、又有轮生，还有是在单边生长，每一小梗都是顶端才着生孢子(见图4)。

Figure 2. Strain A1.4 colony and morphology of acremonium. (a) Colony; (b) Conidiophore and conidia; Bar = 10 μm

图2. 菌株A1.4枝顶孢霉的菌落形态以及显微形态。(a) 菌落形态；(b) 分生孢子和分生孢子梗；标尺= 10 μm

Figure 3. Strain B2.1 colony and morphology of penicillium. (a) Colony; (b) Conidiophore and conidia; Bar = 10 μm

图3. 菌株B2.1青霉的菌落形态以及显微形态。(a) 菌落形态；(b) 分生孢子和分生孢子梗；标尺 = 10 μm

Figure 4. Strain A1.2 colony and morphology of engyodontium. (a) Colony; (b) Conidiophore and conidia; Bar = 10 μm

图4. 菌株A1.2侧齿霉的菌落形态以及显微形态。(a) 菌落形态；(b) 分生孢子和分生孢子梗；标尺 = 10 μm

3.2.5. 枝孢霉属Cladosporium

PDA培养基培养，10天左右长满整个培养基，枝孢霉菌落的颜色呈橄榄绿黑色，培养基由橙色变成黑色，质地较硬，菌落呈绒状、絮状等。分生孢子梗簇生，都是连在一起像一条链那样生长，暗褐色，不进行分枝或者偶分枝，有隔膜，平滑，基部细胞稍稍膨大。分生孢子链生，头球形、卵球形，无隔膜，平滑或具刺，浅褐色(见图5)。

Figure 5. Strain C4.1 colony and morphology of cladosporium. (a) Colony; (b) Conidiophore and conidia; Bar = 10 μm

图5. 菌株C4.1 枝孢霉的菌落形态以及显微形态。(a) 菌落形态；(b) 分生孢子和分生孢子梗；标尺 = 10 μm

4. 结论与讨论

4.1. 结论

研究结果表明，桐花树根际海泥的真菌种类存在多样性，不同时期的样品分离获得的菌株数不一样。分离获得的54株真菌菌株，分属于曲霉属Aspergillus、枝顶孢霉属Acremonium、青霉属Penicillium、侧齿霉属Engyodontium、青霉属Penicillium和枝孢霉属Cladosporium。其中曲霉属为第一优势属。统计结果显示，桐花树根际海泥的真菌以春季样品分离的菌株数最多，其次是夏季，最少的是冬季。

4.2. 讨论

据报道，我国南海海域的丝状真菌有曲霉、青霉、枝顶孢霉、枝孢霉等 [9]，本研究结果与之相一致。别外，有报道样品来自广东湛江湾的海水真菌多样性Shannon指数达2.75，物种优势度变化范围为30.90%~0.02%。枝孢属的优势度最高，为湛江湾优势种群，其次是青霉属、侧齿霉属、曲霉属、枝顶孢属等 [10]。这与本研究结果曲霉属为第一优势属不一致，可能是枝孢属更适合在水体生存，而曲霉属对水体底层的海泥有更强的适应性。本研究结果显示，春季分离的菌株数最多，说明海洋微生物与陆地微生物有共同的季节感应性，春季温度回升，生理活性增强，生长繁殖速度加快，因而数量增多明显；冬季温度降低，生理活性减缓，生长繁殖受到抑制，因而数量减少。

据报道，曲霉和青霉为陆地及海洋常见菌，一般营腐生生活，极少引致植物病害；而枝孢霉为陆地植物的常见致病菌 [11]，也是红树植物的条件致病菌 [12]。因此，了解桐花树根际海泥真菌的种群结构，掌握其不同时期的变化规律，对桐花树的保护有重要意义。

基金项目

广东省科技厅基金项目，海洋酸化对红树内生真菌多样性及致病性的影响(2016A030313746)及广东海洋大学大学生创新创业训练计划项目(CQ201810566073)。

NOTES

*第一作者。

#通讯作者。