黄瓜花叶病毒香蕉坏死株系侵染性克隆的构建
黄瓜花叶病毒香蕉坏死株系侵染性克隆的构建
【摘要】：黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的成员,该病毒危害严重、寄主范围广泛,可侵染1000多种植物。侵染性克隆是研究病毒基因组结构和功能的常见工具,目前已被广泛应用于植物表达载体和病毒沉默载体的运用等方面。2020年7月,笔者实验室于广东省清远市英德县发现香蕉植株的叶片和假茎呈现坏死症状,经检测发现侵染该植株的病毒为CMV,进一步鉴定该病毒株为香蕉上新发现的坏死株系。为了明确该株系的致病机制,笔者在克隆病毒全基因组的基础上,构建了该株系的侵染性克隆。结果表明,该株系的RNA1全长为3 355 bp,内含1a ORF,编码994个氨基酸的1a蛋白,RNA1与亚组Ⅰ株系核苷酸序列同源性为91.20%～98.30%。CMV RNA2全长3 047 bp,包含2个ORF,2a ORF编码858个氨基酸的2a蛋白,2b ORF序列长336 bp的5'端与2a ORF的3‘端重叠,编码113个氨基酸的2b蛋白;RNA2与亚组Ⅰ核苷酸同源性为91.42%～97.86%。CMV RNA3全长2 208 bp,内含2个ORF,其中3a ORF编码280个氨基酸的3a蛋白,CP ORF编码219个氨基酸的CP蛋白;CMV RNA3与亚组Ⅰ同源性为90.81%～95.18%。进化树分析表明,该株系属于亚组Ⅰ。以微型植物表达载体pCB301为模板,利用同源重组的方法分别将CMV RNA1、RNA2、RNA3的完整基因片段构建到植物表达载体的35S启动子和HDZ核酶之间,从而构建成功了pCB301-CMV-RNA1、pCB301-CMV-RNA2和pCB301-CMV-RNA3重组质粒。通过农杆菌介导的方法,将上述混合重组质粒注射到6叶期本生烟,发现注射后第8天,本生烟呈现皱缩症状,经PCR检测在系统叶中发现有CMV。该CMV株系的基因功能研究正在进行中。
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