狐狸源伪狂犬病毒HB1株的分离鉴定及生物学特性分析
【摘要】： 伪狂犬病(pseudorabies,PR)是伪狂犬病毒引起的多种家畜和野生动物的一种急性传染病。伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)属疱疹病毒科水痘病毒属猪疱疹病毒Ⅰ型。PRV的宿主感染谱非常广泛,能感染绝大多数的哺乳动物,包括猪、牛、羊、狗、猫、兔、狐狸、水貂和貉等动物。2011年以来,PRV变异毒株在中国中东部地区广泛流行,给养殖业的发展带来了非常大的影响。PRV是影响狐狸养殖业的重要的病毒性病原之一,狐狸PR的主要临床症状为神经系统症状和呼吸道症状。目前暂无狐狸专用的PRV疫苗,其防控形势严峻。本研究从发生PR的狐狸场,分离鉴定狐狸源PRV流行毒株,并对其进行生物学特性的研究,揭示了狐狸PR的发生和流行特征,为其有效的防控奠定基础。本研究从河北地区采集到疑似感染PRV死亡狐狸病料,组织病料经研磨处理后,提取组织的病毒DNA,进行PRV的PCR检测,PCR结果为PRV阳性。将病料接种PK15细胞传代培养,PK15细胞出现典型的PRV CPE变化。通过噬斑纯化,获得了狐狸源PRV分离株纯化病毒。间接免疫荧光试验结果表明,该PRV分离株可与PRV Bartha K-61株和PRV HeN1株的阳性血清发生特异性反应,产生特异性荧光,将该分离株命名为PRV HB1株。HB1株的的透射电子显微镜观察结果显示,病毒近似圆球形,直径约为150-180 nm,符合疱疹病毒粒子的形态。HB1株可感染PK15等12种细胞,但在不同细胞的CPE变化和增殖特性不同,以微量法测得HB1株在PK15细胞上的滴度为10~(7.67)TCID_(50)/mL。一步生长曲线表明,HB1株与Bartha K-61株和SC株具有相似的生长动力学,且HB1株在PK15细胞上的滴度最高。中和试验结果表明,Bartha K-61阳性血清和HeN1阳性血清能够中和HB1株的最高稀释度分别为8倍和32倍,HeN1变异株的抗血清能够完全中和HB1株,而Bartha K-61疫苗株的抗血清不能完全中和HB1株。以96对引物对HB1株进行基因组的分段测序,最终共得到HB1株的52个基因的序列,遗传演化分析表明,HB1株属于PRV基因Ⅱ型,HB1 gE基因与Becker和Kaplan株的同源性为97.9%,与HBCL和TJ等国内分离株的同源性均达到99%以上;与欧美等国外参考毒株相比,HB1株gE基因编码的氨基酸序列共存在19个替换和2个插入。HB1 gC基因与Bartha、Becker、Kaplan和SC株的同源性为96.2%,与HBCL、HLJ8和JS-2012等国内变异株的同源性均达到99.5%以上;与欧美等国外参考毒株相比,HB1 gC基因编码的氨基酸序列共存在27个替换,及在第63-69位存在一个AAASTPA的连续7个氨基酸插入,这与国内近年来猪群流行的变异株的特征一致。以10~(4.67)、10~(5.67)、10~(6.67)和10~(7.67 )TCID_(50)/mL的HB1株分别接种BALB/c小鼠,小鼠可表现瘙痒和呼吸困难等典型临床症状和脑多量少突胶质细胞增生和肺泡壁增厚等病理变化。10~(7.67)TCID_(50)/mL感染组,5/5小鼠全部死亡;10~(6.67)TCID_(50)/mL感染组,4/5只小鼠死亡;10~(5.67)TCID_(50)/mL感染组,3/5只小鼠死亡,10~(4.67)TCID_(50)/mL感染组,5只小鼠均无死亡。按照Reed-Muench法,计算出HB1株对BALB/c小鼠的半数致死量LD_(50)=1×10~(5.02) TCID_(50)/mL。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
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