同时检测七种水仙RNA病毒的多重RT

• 花匠小妙招
• 2024-11-23 11:45

本发明涉及同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境口岸检疫和农业生产上水仙主要rna病毒的快速检测。

背景技术：

水仙(narcissustazettal.)属于石蒜科(amaryllidaceae)水仙属(narcissus)多年生草本植物，是世界著名的观赏球根花卉。水仙作为我国传统出口名花，同时也是福建省省花，在我国花卉生产中占据着十分重要的地位。病毒病是水仙上的主要病害，引起种球变小、花箭减小、香气变淡、鳞茎退化和植株矮化等一系列症状，造成水仙的产量和品质严重下降。目前，国内外已报道可侵染水仙的主要rna病毒包括水仙黄条病毒(narcissusyellowstripevirus，nysv)、水仙退化病毒(narcissusdegenerationvirus，ndv)、水仙潜隐病毒(narcissuslatentvirus，nlv)、南芥菜花叶病毒(arabismosaicvirus，armv)、水仙普通潜隐病毒(narcissuscommonlatentvirus，nclv)、水仙花叶病毒(narcissusmosaicvirus，nmv)和尼润潜隐病毒(nerinelatentvirus，nelv)。由于水仙绝大多数以无性方式繁殖，一旦种球带毒，病毒将在种球内不断积累，导致种球退化，并通过子代进一步传播和扩散，成为远距离和大范围传播的重要途径。

水仙病毒病的防治极其困难，至今尚无完全有效的方法。加强病毒的早期检测，及时采取防控措施，仍是预防与控制水仙病毒病的重要手段。目前已报道的水仙病毒检测方法包括生物学测定、电镜观察、血清学检测和分子生物学检测方法四种，主要是针对单个病毒或2-3个病毒进行检测，无法对水仙上需要关注的七种主要rna病毒(水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒)进行一次性同时检测。建立用于水仙上七种主要rna病毒的高通量分子生物学检测方法，将极大地提高检测效率，节约检测成本。关于同时检测水仙上七种主要rna病毒水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的方法至今尚未见报道，更未见专门的七重rt-pcr检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是如何同时检测如下七种水仙rna病毒：水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了用于鉴定七种水仙rna病毒的成套引物对。

本发明提供的用于鉴定七种水仙rna病毒的成套引物对由用于鉴定水仙黄条病毒的特异引物对a、用于鉴定水仙退化病毒的特异引物对b、用于鉴定水仙潜隐病毒的特异引物对c、用于鉴定南芥菜花叶病毒的特异引物对d、用于鉴定水仙普通潜隐病毒的特异引物对e、用于鉴定水仙花叶病毒的特异引物对f和用于鉴定尼润潜隐病毒的特异引物对g组成；

所述特异引物对a由引物nysv-f和引物nysv-r组成；

所述特异引物对b由引物ndv-f和引物ndv-r组成；

所述特异引物对c由引物nlv-f和引物nlv-r组成；

所述特异引物对d由引物armv-f和引物armv-r组成。

所述特异引物对e由引物nclv-f和引物nclv-r组成；

所述特异引物对f由引物nmv-f和引物nmv-r组成；

所述特异引物对g由引物nelv-f和引物nelv-r组成；

所述引物nysv-f为如下a1)或a2)：

a1)序列表中序列1所示的单链dna分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nysv-r为如下a3)或a4)：

a3)序列表中序列2所示的单链dna分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链dna分子；

所述引物ndv-f为如下b1)或b2)：

b1)序列表中序列3所示的单链dna分子；

b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物ndv-r为如下b3)或b4)：

b3)序列表中序列4所示的单链dna分子；

b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nlv-f为如下c1)或c2)：

c1)序列表中序列5所示的单链dna分子；

c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nlv-r为如下c3)或c4)：

c3)序列表中序列6所示的单链dna分子；

c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述引物armv-f为如下d1)或d2)：

d1)序列表中序列7所示的单链dna分子；

d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物armv-r为如下d3)或d4)：

d3)序列表中序列8所示的单链dna分子；

d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nclv-f为如下e1)或e2)：

e1)序列表中序列9所示的单链dna分子；

e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nclv-r为如下e3)或e4)：

e3)序列表中序列10所示的单链dna分子；

e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nmv-f为如下f1)或f2)：

f1)序列表中序列11所示的单链dna分子；

f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nmv-r为如下f3)或f4)：

f3)序列表中序列12所示的单链dna分子；

f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nelv-f为如下g1)或g2)：

g1)序列表中序列13所示的单链dna分子；

g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链dna分子；

所述引物nelv-r为如下b3)或b4)：

g3)序列表中序列14所示的单链dna分子；

g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链dna分子；

所述七种水仙rna病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。

上述成套引物对中，所述引物nysv-f、所述引物nysv-r、所述引物ndv-f、所述引物ndv-r、所述引物nlv-f、所述引物nlv-r、所述引物armv-f、所述引物armv-r、所述引物nclv-f、所述引物nclv-r、所述引物nmv-f、所述引物nmv-r、所述引物nelv-f和所述引物nelv-r的摩尔比为1:1:1:1:1:1:4:4:2:2:2:2:4:4。

本发明的成套引物对除可同时检测上述7种水仙rna病毒外，也可检测7种水仙rna病毒中的某1种、2种、3种、4种、5种或6种病毒。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了上述成套引物对的新用途。

本发明提供了上述成套引物对在如下h1)-h8)中任一所述的应用：

h1)制备用于鉴定七种水仙rna病毒的产品；

h2)鉴定七种水仙rna病毒；

h3)制备用于鉴定待测病毒是否为七种水仙rna病毒的产品；

h4)鉴定待测病毒是否为七种水仙rna病毒；

h5)制备用于鉴别七种水仙rna病毒的产品；

h6)鉴别七种水仙rna病毒；

h7)制备用于检测待测样品中是否含有七种水仙rna病毒的产品；

h8)检测待测样品中是否含有七种水仙rna病毒；

所述七种水仙rna病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了含有上述成套引物对的试剂盒；

所述试剂盒的功能为如下i1)-i4)中任一种：

i1)鉴定七种水仙rna病毒中1-7种；

i2)鉴定待测病毒是否为七种水仙rna病毒；

i3)鉴别七种水仙rna病毒；

i4)检测待测样品中是否含有七种水仙rna病毒；

所述七种水仙rna病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。

本发明的试剂盒还包括randomprimers(随机引物)，rtbuffer，rna酶抑制因子，反转录酶，taqpcrmix，rnase-freeddh2o，含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的阳性对照样品及不含水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的阴性对照样品。

上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。

所述试剂盒的制备方法为如下(ⅰ)或(ⅱ)：

(ⅰ)上述成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；

(ⅱ)上述成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。

上述方法中，所述引物nysv-f、所述引物nysv-r、所述引物ndv-f、所述引物ndv-r、所述引物nlv-f、所述引物nlv-r、所述引物armv-f、所述引物armv-r、所述引物nclv-f、所述引物nclv-r、所述引物nmv-f、所述引物nmv-r、所述引物nelv-f和所述引物nelv-r按照摩尔比为1:1:1:1:1:1:4:4:2:2:2:2:4:4的比例混合在一起。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴定待测病毒是否为七种水仙rna病毒的方法。

本发明提供的鉴定待测病毒是否为七种水仙rna病毒的方法包括如下步骤：以待测病毒的cdna为模板，采用上述成套引物对进行rt-pcr扩增，得到rt-pcr扩增产物；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为747bp的条带，则所述待测病毒为水仙黄条病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为588bp的条带，则所述待测病毒为水仙退化病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为498bp的条带，则所述待测病毒为水仙潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为360bp的条带，则所述待测病毒为南芥菜花叶病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为295bp的条带，则所述待测病毒为水仙普通潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为199bp的条带，则所述待测病毒为水仙花叶病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为169bp的条带，则所述待测病毒为尼润潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中不含有大小为747bp的条带且不含有大小为588bp的条带且不含有大小为498bp的条带且不含有大小为360bp的条带且不含有大小为295bp的条带且不含有大小为199bp的条带且不含有大小为169bp的条带，则所述待测病毒不为七种水仙rna病毒；

所述七种水仙rna病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒或尼润潜隐病毒。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种鉴别七种水仙rna病毒的方法。

本发明提供的鉴别七种水仙rna病毒的方法包括如下步骤：以待测病毒的cdna为模板，采用上述成套引物对进行rt-pcr扩增，得到rt-pcr扩增产物；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为747bp的条带，则所述待测病毒为水仙黄条病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为588bp的条带，则所述待测病毒为水仙退化病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为498bp的条带，则所述待测病毒为水仙潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为360bp的条带，则所述待测病毒为南芥菜花叶病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为295bp的条带，则所述待测病毒为水仙普通潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为199bp的条带，则所述待测病毒为水仙花叶病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为169bp的条带，则所述待测病毒为尼润潜隐病毒；

所述七种水仙rna病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒或尼润潜隐病毒。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测待测样品中是否含有七种水仙rna病毒的方法。

本发明提供的检测待测样品中是否含有七种水仙rna病毒的方法包括如下步骤：以待测样品的cdna为模板，采用上述成套引物对进行rt-pcr扩增，得到rt-pcr扩增产物；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为747bp的条带，则所述待测样品含有水仙黄条病毒；反之则所述待测样品不含有水仙黄条病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为588bp的条带，则所述待测样品含有水仙退化病毒；反之则所述待测样品不含有水仙退化病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为498bp的条带，则所述待测样品含有水仙潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有水仙潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为360bp的条带，则所述待测样品含有南芥菜花叶病毒；反之则所述待测样品不含有南芥菜花叶病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为295bp的条带，则所述待测样品含有水仙普通潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有水仙普通潜隐病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为199bp的条带，则所述待测样品含有水仙花叶病毒；反之则所述待测样品不含有水仙花叶病毒；

若所述rt-pcr扩增产物中含有大小为169bp的条带，则所述待测样品含有尼润潜隐病毒；反之则所述待测样品不含有尼润潜隐病毒；

总之，若所述rt-pcr扩增产物中同时出现含有1-7条对应大小的条带，则所述待测样品含有与条带大小对应的病毒种类。

所述七种水仙rna病毒为水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和/或尼润潜隐病毒。

上述方法中，所述rt-pcr扩增的反应体系如下：cdna3μl、2×taqpcrmix12.5μl、浓度为1μmol/lnysv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnysv-反向引物0.625μl、浓度为1μmol/lndv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lndv-反向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnlv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnlv-反向引物0.625μl、浓度为5μmol/larmv-正向引物0.5μl、浓度为5μmol/larmv-反向引物0.5μl、浓度为5μmol/lnclv-正向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnclv-反向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnmv-正向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnmv-反向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnelv-正向引物0.5μl、浓度为5μmol/lnelv-反向引物0.5μl、rnase-freeddh2o2.75μl，使反应总体积为25μl；所述rt-pcr扩增的反应条件如下：94℃预变性15min，然后94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。

上述方法中，所述cdna是以待测病毒或待测样品的rna为模板进行反转录得到的。所述反转录的具体方法如下：先向pcr管中加入待测病毒或待测样品总rna3μl、浓度为100μmol/l的随机引物1μl、rnase-freeddh2o7μl，70℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×rtbuffer5μl、浓度为10mmol/ldntps2μl、浓度为200u/μl反转录酶1μl、浓度为40u/μlrna酶抑制因子1μl。42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cdna。

为了解决上述技术问题，本发明最后还提供了上述特异引物对a或上述特异引物对b或上述特异引物对c或上述特异引物对d或上述特异引物对e或上述特异引物对f或上述特异引物对g。

如下n1)-n21)任一所述的应用也属于本发明的保护范围：

n1)上述特异引物对a在制备用于检测水仙黄条病毒的产品中的应用；

n2)上述特异引物对a在鉴定水仙黄条病毒中的应用；

n3)上述特异引物对a在鉴定待测病毒是否为水仙黄条病毒中的应用；

n4)上述特异引物对b在制备用于检测水仙退化病毒的产品中的应用；

n5)上述特异引物对b在鉴定水仙退化病毒中的应用；

n6)上述特异引物对b在鉴定待测病毒是否为水仙退化病毒中的应用；

n7)上述特异引物对c在制备用于检测水仙潜隐病毒的产品中的应用；

n8)上述特异引物对c在鉴定水仙潜隐病毒中的应用；

n9)上述特异引物对c在鉴定待测病毒是否为水仙潜隐病毒中的应用；

n10)上述特异引物对d在制备用于检测南芥菜花叶病毒的产品中的应用；

n11)上述特异引物对d在鉴定南芥菜花叶病毒中的应用；

n12)上述特异引物对d在鉴定待测病毒是否为南芥菜花叶病毒中的应用；

n13)上述特异引物对e在制备用于检测水仙普通潜隐病毒的产品中的应用；

n14)上述特异引物对e在鉴定水仙普通潜隐病毒中的应用；

n15)上述特异引物对e在鉴定待测病毒是否为水仙普通潜隐病毒中的应用；

n16)上述特异引物对f在制备用于检测水仙花叶病毒的产品中的应用；

n17)上述特异引物对f在鉴定水仙花叶病毒中的应用；

n18)上述特异引物对f在鉴定待测病毒是否为水仙花叶病毒中的应用；

n19)上述特异引物对g在制备用于检测尼润潜隐病毒的产品中的应用；

n20)上述特异引物对g在鉴定尼润潜隐病毒中的应用；

n21)上述特异引物对g在鉴定待测病毒是否为尼润潜隐病毒中的应用。

较现有技术而言，本发明所提供的水仙病毒七重rt-pcr检测试剂盒及其检测方法的有益效果在于：

1)高通量、经济：通过一次实验可以同时最多检测7种不同的水仙病毒，极大地提高了检测效率，且无需克隆、测序和序列比对，只需根据pcr扩增产物的大小即可准确判断病毒种类，显著节约了检测时间和成本。除同时最多检测七种病毒外，也可同时检测某1种、2种、3种、4种、5种或6种病毒；

2)特异性强：7对特异性引物是通过对已报道的7种主要rna病毒基因序列多重比对后在保守区域设计，并分别以多个水仙病毒为检测对象，反复实验、筛选而得到。能够分别从感染水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的各样品上扩增到大小为747bp、588bp、498bp、360bp、295bp、199bp、169bp的特异性目的片段，而从健康样品上未扩增到相应的目的片段；

3)灵敏度高：本发明的成套引物对与各个病毒的单一rt-pcr检测灵敏度相当，非常适合水仙植株上rna病毒的早期检测。

本发明根据水仙上已报道的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒7种主要rna病毒基因序列，设计、筛选出七对特异性引物，并经引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数等参数的反复优化确定了最佳rt-pcr反应体系和反应程序，提供了七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及检测方法。通过实验证明：本发明的多重rt-pcr检测试剂盒及检测方法可同时检测七种水仙主要的rna病毒，具有检测效率高、特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点。

附图说明

图1为实施例2的同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的检测结果。其中，1：含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒样品；2：阴性对照；3：空白对照。

图2为实施例3的特异性的检测结果。其中，1：含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒样品；2：水仙黄条病毒样品；3：水仙退化病毒样品；4：水仙潜隐病毒样品；5：南芥菜花叶病毒样品；6：水仙普通潜隐病毒样品；7：水仙花叶病毒样品；8：尼润潜隐病毒样品；9：阴性对照。

图3为实施例4的灵敏度的检测结果。其中，1：100；2：10-1稀释；3：10-2稀释；4：10-3稀释；5：10-4稀释；6：10-5稀释；7：10-6稀释；8：10-7稀释；9：阴性对照。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒

一、用于检测七种水仙rna病毒的成套引物对

本发明根据水仙上已报道的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒7种主要rna病毒基因序列，通过靶片段选择，设计并筛选出七对特异性引物。

本发明设计的用于检测水仙黄条病毒(narcissusyellowstripevirus，nysv)的引物对由nysv-正向引物和nysv-反向引物组成，其扩增产物大小为747bp。引物序列如下：

nysv-正向引物：5’-gtgtcgccagtgaagtacgg-3’(序列1)；

nysv-反向引物：5’-ccctcacgcctagaaggttg-3’(序列2)；

本发明设计的用于检测水仙退化病毒(narcissusdegenerationvirus，ndv)的引物对由ndv-正向引物和ndv-反向引物组成，其扩增产物大小为588bp。引物序列如下：

ndv-正向引物：5’-gaagttcaaaggtatgagttccaag-3’(序列3)；

ndv-反向引物：5’-ctcccaatcttcgcatctaagc-3’(序列4)；

本发明设计的用于检测水仙潜隐病毒(narcissuslatentvirus，nlv)的引物对由nlv-正向引物和nlv-反向引物组成，其扩增产物大小为498bp。引物序列如下：

nlv-正向引物：5’-taagaaatcactcgccctca-3’(序列5)；

nlv-反向引物：5’-gaaccatgctcatattcgcta-3’(序列6)；

本发明设计的用于检测南芥菜花叶病毒(arabismosaicvirus，armv)的引物对由armv-正向引物和armv-反向引物组成，其扩增产物大小为360bp。引物序列如下：

armv-正向引物：5’-gcggattgggagttcgtagt-3’(序列7)；

armv-反向引物：5’-attccagttgttagtgacccc-3’(序列8)；

本发明设计的用于检测水仙普通潜隐病毒(narcissuscommonlatentvirus，nclv)的引物对由nclv-正向引物和nclv-反向引物组成，其扩增产物大小为295bp。引物序列如下：

nclv-正向引物：5’-accccagcaatccttacaatcg-3’(序列9)；

nclv-反向引物：5’-ctcagggtactcgcatccttc-3’(序列10)；

本发明设计的用于检测水仙花叶病毒(narcissusmosaicvirus，nmv)的引物对由nmv-正向引物和nmv-反向引物组成，其扩增产物大小为199bp。引物序列如下：

nmv-正向引物：5’-cccgaatagagctccatcact-3’(序列11)；

nmv-反向引物：5’-cactgctgaacgactcgcttg-3’(序列12)；

本发明设计的用于检测尼润潜隐病毒(nerinelatentvirus，nelv)的引物对由nelv-正向引物和nelv-反向引物组成，其扩增产物大小为169bp。引物序列如下：

nelv-正向引物：5’-gaacccagcagcaattaaacc-3’(序列13)；

nelv-反向引物：5’-cgttttgcaaccatacagcc-3’(序列14)；

用于检测水仙黄条病毒的引物对、用于检测水仙退化病毒的引物对、用于检测水仙潜隐病毒的引物对、用于检测南芥菜花叶病毒的引物对、用于检测水仙普通潜隐病毒的引物对、用于检测水仙花叶病毒的引物对和用于检测尼润潜隐病毒的引物对共同组成了本发明的用于检测七种水仙rna病毒的成套引物对。

二、同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的配置(10次检测量)

本发明的同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒由如下1)-23)所示的试剂组成：

1)nysv-正向引物：1μmol/l，5’-gtgtcgccagtgaagtacgg-3’，1管(10μl)；

2)nysv-反向引物：1μmol/l，5’-ccctcacgcctagaaggttg-3’，1管(10μl)；

3)ndv-正向引物：1μmol/l，5’-gaagttcaaaggtatgagttccaag-3’，1管(10μl)；

4)ndv-反向引物：1μmol/l，5’-ctcccaatcttcgcatctaagc-3’，1管(10μl)；

5)nlv-正向引物：1μmol/l，5’-taagaaatcactcgccctca-3’，1管(10μl)；

6)nlv-反向引物：1μmol/l，5’-gaaccatgctcatattcgcta-3’，1管(10μl)；

7)armv-正向引物：5μmol/l，5’-gcggattgggagttcgtagt-3’，1管(10μl)；

8)armv-反向引物：5μmol/l，5’-attccagttgttagtgacccc-3’，1管(10μl)；

9)nclv-正向引物：5μmol/l，5’-accccagcaatccttacaatcg-3’，1管

(10μl)；

10)nclv-反向引物：5μmol/l，5’-ctcagggtactcgcatccttc-3’，1管(10μl)；

11)nmv-正向引物：5μmol/l，5’-cccgaatagagctccatcact-3’，1管(10μl)；

12)nmv-反向引物：5μmol/l，5’-cactgctgaacgactcgcttg-3’，1管(10μl)；

13)nelv-正向引物：5μmol/l，5’-gaacccagcagcaattaaacc-3’，1管

(10μl)；

14)nelv-反向引物：5μmol/l，5’-cgttttgcaaccatacagcc-3’，1管(10μl)；

15)randomprimers(随机引物)：100μmol/l，1管(20μl)；

16)rtbuffer：5×，1管(100μl)；

17)rna酶抑制因子：40u/μl，1管(20μl)；

18)反转录酶：200u/μl，1管(20μl)；

19)dntps：10mmol/l，1管(50μl)；

20)taqpcrmix：2×，1管(200μl)；

21)含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的阳性对照样品，1管(10ml)；

22)不含水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的阴性对照样品，1管(10ml)；

23)rnase-freeddh2o，1管(10ml)。

实施例2、同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的检测方法

一、同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr反应体系的建立及反应条件的优化

以含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒样品，水仙黄条病毒样品，水仙退化病毒样品，水仙潜隐病毒样品，南芥菜花叶病毒样品，水仙普通潜隐病毒样品，水仙花叶病毒样品和尼润潜隐病毒样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒。

1)反转录反应：先向pcr管中加入待测样品总rna3μl、浓度为100μmol/l的随机引物1μl、rnase-freeddh2o7μl，70℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×rtbuffer5μl、浓度为10mmol/ldntps2μl、浓度为200u/μl反转录酶1μl和浓度为40u/μlrna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cdna；

2)多重rt-pcr反应体系：在pcr管中加入步骤1)获得的cdna3μl，每管加入2×taqpcrmix12.5μl、不同浓度的nysv-正向引物0.625μl、不同浓度的nysv-反向引物0.625μl、不同浓度的ndv-正向引物0.625μl、不同浓度的ndv-反向引物0.625μl、不同浓度的nlv-正向引物0.625μl、不同浓度的nlv-反向引物0.625μl、不同浓度的armv-正向引物0.5μl、不同浓度的armv-反向引物0.5μl、不同浓度的nclv-正向引物0.25μl、不同浓度的nclv-反向引物0.25μl、不同浓度的nmv-正向引物0.25μl、不同浓度的nmv-反向引物0.25μl、不同浓度的nelv-正向引物0.5μl、不同浓度的nelv-反向引物0.5μl、rnase-freeddh2o2.75μl，使反应总体积为25μl；

3)将步骤2)建立的反应体系在下述条件下反应：94℃预变性15min，然后94℃变性30s，不同温度下退火1.5min，72℃延伸不同时间，如此进行不同个数的循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。

上述步骤2)中的“不同浓度”为10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l。每个病毒的正向引物和反向引物的浓度之间做了排列组合，如正向引物浓度为10μmol/l时，反向引物的浓度分别为10μmol/l、9μmol/l、8μmol/l、7μmol/l、6μmol/l、5μmol/l、4μmol/l、3μmol/l、2μmol/l、1μmol/l、0.5μmol/l、0.25μmol/l、0.125μmol/l或0.0625μmol/l，共14个浓度组合；不同病毒之间也按上述方法做了排列组合；

上述步骤3)中的“不同温度”为50℃、50.5℃、51℃、51.5℃、52℃、52.5℃、53℃、53.5℃、54℃、54.5℃、55℃、55.5℃、56℃、56.5℃、57℃、57.5℃、58℃、58.5℃、59℃、59.5℃或60℃；

上述步骤3)中的“不同时间”为0.5min、1min、1.5min、2min、2.5min或3min；

上述步骤3)中的“不同个数”为5个、10个、25个、30个、35个或40个。

取pcr反应产物10μl，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。结果表明：多重rt-pcr扩增的最佳反应体系为：cdna3μl、2×taqpcrmix12.5μl、浓度为1μmol/lnysv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnysv-反向引物0.625μl、浓度为1μmol/lndv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lndv-反向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnlv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnlv-反向引物0.625μl、浓度为5μmol/larmv-正向引物0.5μl、浓度为5μmol/larmv-反向引物0.5μl、浓度为5μmol/lnclv-正向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnclv-反向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnmv-正向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnmv-反向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnelv-正向引物0.5μl、浓度为5μmol/lnelv-反向引物0.5μl、rnase-freeddh2o2.75μl，使反应总体积为25μl；最佳反应条件为：94℃预变性15min，然后94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束。

二、同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的检测方法

以含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒样品为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒。具体步骤如下：

1)反转录反应：先向pcr管中加入待测样品总rna3μl、浓度为100μmol/l的随机引物1μl、rnase-freeddh2o7μl，70℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×rtbuffer5μl、浓度为10mmol/ldntps2μl、浓度为200u/μl反转录酶1μl、浓度为40u/μlrna酶抑制因子1μl，42℃水浴60min，70℃水浴10min，合成cdna；

2)多重rt-pcr反应：取步骤1)合成的cdna3μl，每管加入2×taqpcrmix12.5μl、浓度为1μmol/lnysv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnysv-反向引物0.625μl、浓度为1μmol/lndv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lndv-反向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnlv-正向引物0.625μl、浓度为1μmol/lnlv-反向引物0.625μl、浓度为5μmol/larmv-正向引物0.5μl、浓度为5μmol/larmv-反向引物0.5μl、浓度为5μmol/lnclv-正向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnclv-反向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnmv-正向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnmv-反向引物0.25μl、浓度为5μmol/lnelv-正向引物0.5μl、浓度为5μmol/lnelv-反向引物0.5μl、rnase-freeddh2o2.75μl，使反应总体积为25μl；混合后的反应液于94℃预变性15min，然后94℃变性30s，54℃退火1.5min，72℃延伸1.5min，如此共30个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束；

3)pcr扩增产物电泳检测：取pcr反应产物10μl，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果。

电泳检测结果如图1所示。含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的待测样品的pcr扩增产物在747bp、588bp、498bp、360bp、295bp、199bp、169bp处均出现明亮的dna条带。

实施例3、同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的特异性测定

分别以含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒样品，水仙黄条病毒样品，水仙退化病毒样品，水仙潜隐病毒样品，南芥菜花叶病毒样品，水仙普通潜隐病毒样品，水仙花叶病毒样品和尼润潜隐病毒样品作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1)-3)。

结果如图2所示。含有水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒的待测样品的pcr扩增产物在747bp、588bp、498bp、360bp、295bp、199bp、169bp处均出现明亮的dna条带；水仙黄条病毒样品，水仙退化病毒样品，水仙潜隐病毒样品，南芥菜花叶病毒样品，水仙普通潜隐病毒样品，水仙花叶病毒样品和尼润潜隐病毒样品的pcr扩增产物则分别仅在747bp、588bp、498bp、360bp、295bp、199bp、169bp处出现单一明亮的dna条带，而从阴性对照上未扩增到任何特异性dna条带。说明本发明的试剂盒具有较强的特异性。

实施例4、同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒的灵敏度测定

将水仙黄条病毒样品、水仙退化病毒样品、水仙潜隐病毒样品、南芥菜花叶病毒样品、水仙普通潜隐病毒样品、水仙花叶病毒样品和尼润潜隐病毒样品的模板分别稀释至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6和10-7倍后作为待测样品，采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1)-3)。

结果如图3所示。由图3可知，本发明的方法可以分别检测稀释到10-3倍的水仙黄条病毒样品、水仙退化病毒样品和水仙潜隐病毒样品，10-2倍的南芥菜花叶病毒样品，10-4倍的水仙普通潜隐病毒样品和水仙花叶病毒样品，10-1倍的尼润潜隐病毒样品。说明本发明试剂盒具有较高的灵敏度。

实施例5、水仙样品的实际检测

以我国口岸进口的荷兰水仙和福建、上海等地采集的中国水仙共50份作为待测样品，其中，我国口岸进口的荷兰水仙共有tahiti、dutchmaster、icefollies、pinkcharm、geranium、lasvegas、babyboomer、avalanche和hawere9个品种，福建、上海等地采集的中国水仙共有单瓣水仙、复瓣水仙2个品种。

提取待测样品的rna后采用实施例1中的试剂盒检测待测样品中的水仙黄条病毒、水仙退化病毒、水仙潜隐病毒、南芥菜花叶病毒、水仙普通潜隐病毒、水仙花叶病毒和尼润潜隐病毒。具体步骤同实施例2中的步骤1)-3)。试验同时以单一引物的普通rt-pcr方法进行各个病毒的验证，采用nysv-正向引物和nysv-反向引物对水仙黄条病毒进行检测，采用ndv-正向引物和ndv-反向引物对水仙退化病毒进行检测，采用nlv-正向引物和nlv-反向引物对水仙潜隐病毒进行检测，采用armv-正向引物和armv-反向引物对南芥菜花叶病毒进行检测，采用nclv-正向引物和nclv-反向引物对水仙普通潜隐病毒进行检测，采用nmv-正向引物和nmv-反向引物对水仙花叶病毒进行检测，采用nelv-正向引物和nelv-反向引物对尼润潜隐病毒进行检测，具体步骤参照实施例2中的步骤1)-3)。

结果表明：本发明的方法检出的感染水仙黄条病毒的水仙样品27份、感染水仙退化病毒的水仙样品22份、感染水仙潜隐病毒的水仙样品10份、感染南芥菜花叶病毒的水仙样品6份、感染水仙普通潜隐病毒的水仙样品19份、感染水仙花叶病毒的水仙样品11份和感染尼润潜隐病毒的水仙样品5份；复合侵染的样品有33份。上述检测结果与普通rt-pcr方法检测结果完全一致。说明本发明的方法检测结果准确可靠。

序列表

<110>福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120>同时检测七种水仙rna病毒的多重rt-pcr检测试剂盒及其检测方法

<160>14

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