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高效提取牡丹原花色素的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-23 12:02

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911183094.X (22)申请日 2019.11.27 (71)申请人菏泽学院地址 274015 山东省菏泽市大学路2269号菏泽学院综合办公楼 (72)发明人张海丽刘飞钱礼尧张梦琪王慧琪 (74)专利代理机构北京国坤专利代理事务所 (普通合伙) 11491 代理人赵红霞 (51)Int.Cl. C07D 311/62(2006.01) A61P 39/06(2006.01) C09B 61/00(2006.01) C09B 67/54(2006.01)。

2、 (54)发明名称一种高效提取牡丹原花色素的方法 (57)摘要本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种高效提取牡丹原花色素的方法。本发明所述高效提取牡丹原花色素的方法，通过采用喷洒复合酶制剂并进行堆渥的方式，对牡丹花瓣进行有效的预处理，有助于加速色素成分的转移和扩散，从而提高后续牡丹原花色素再有机溶剂中的浸出效率，以达到原花色素的高效提取。本发明通过体外实验运用分光光度计法分别进行了牡丹原花色素对DPPH、OH、 O2-的清除及总抗氧化能力的测定，证明其在抗氧化方面的效用，为牡丹原花色素的综合利用和深度开发提供科学的参考和依据。权利要求书。

3、1页说明书7页 CN 110845465 A 2020.02.28 CN 110845465 A 1.一种高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)取新鲜牡丹花瓣洗净并晾干，随后将处理后的牡丹花瓣进行自然堆积，并均匀喷洒含有复合酶制剂的复合酶液进行堆渥处理，得到预处理后的牡丹花瓣； (2)直接取预处理后的牡丹花瓣进行有机溶剂浸渍提取，过滤得到粗滤液； (3)将所得粗滤液进行抽滤并浓缩，得到所需牡丹原花色素提取物。 2.根据权利要求1所述高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述复合酶制剂包括纤维素酶和葡萄糖氧化酶。 3.根据权利。

4、要求2所述高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述纤维素酶和葡萄糖氧化酶的质量比为1-3： 1。 4.根据权利要求1-3任一项所述高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，所述步骤 (1)中，所述复合酶制剂的用量占所述牡丹花瓣质量的6-10wt。 5.根据权利要求4所述高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述复合酶液的质量浓度为2-5wt。 6.根据权利要求1-5任一项所述高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，所述步骤 (1)中，所述堆渥步骤中，堆渥温度为28-35，堆渥时间为10-12h。 7.根据权利要求1-6任一。

5、项所述高效提取牡丹原花色素的方法，其特征在于，所述步骤 (2)中，所述有机溶剂浸提步骤包括按照1： 3-5的料液比加入无水乙醇，于常温下进行浸渍提取2-4h的步骤。 8.由权利要求1-7任一项所述高效提取牡丹原花色素的方法制备得到的牡丹原花色素。 9.权利要求8所述牡丹原花色素用于制备抗氧化剂的用途。权利要求书 1/1 页 2 CN 110845465 A 2 一种高效提取牡丹原花色素的方法技术领域 0001 本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种高效提取牡丹原花色素的方法。背景技术 0002 牡丹花(Paeonia suffruticosa Andr.)又名富。

6、贵花，为毛茛科芍药属植物，是我国特有的花卉，素有 “花中之王” 、“国色天香” 的美誉。牡丹有一千九百多年的栽培和培育历史，并逐渐形成了品种丰富的牡丹品种群，在全国各地广为栽培。尤其是我国山东菏泽地区更是世界上最大的牡丹生产、观赏和科研基地，被国家林业局和中国花协命名为 “牡丹之乡” 。 0003 牡丹作为一种名贵花卉不仅有很高的观赏价值，在食品、药品、日化等领域也有着很高的应用价值，已广泛应用于饮料、花茶、花酒和糕点中。早在上世纪，刘建华等人就对牡丹花营养成分进行了分析和评价，研究内容涵盖蛋白质、脂肪、氨基酸、矿物质和维生素等等。张修。

7、景等采用火焰原子吸收光谱法测定了牡丹花中铜、锌、铁、锰、镍和钴的含量，为牡丹花的应用开发提供了依据。据研究报道，牡丹的干燥根皮具有抗肿瘤、保护心血管、增强免疫力等多种药理作用，药用历史悠久；牡丹叶中黄酮含量丰富，对亚硝酸盐的清除作用显著；此外，牡丹叶片中的多糖对羟自由基有一定的清除能力，不同品种牡丹清除能力差异显著；就花而言，除了极高的观赏价值，还具有较高的经济价值和营养价值。 0004 牡丹原花色素是牡丹花中各种呈色物质的总称，属于类黄酮类化合物，主要有花色苷、黄酮和黄酮醇的苷类。有文献报道牡丹原花色素是目前世界上已知的抗氧化性最强的物。

8、质，其抗氧化能力是VE和VC的数倍，且牡丹花中的原花色素具有含量高、提取简便、作用广泛等特点，在降低血压、镇咳、抗肿瘤及增强免疫力等方面也具有较高活性，对人体具有很好的保健作用，并且牡丹原花色素属于天然色素，来源健康、无毒无害，故研究开发牡丹原花色素作用及加工产品非常必要。目前，已知的天然色素提取方法主要包括有机溶剂浸提法、吸附精制法、酶提取法、超临界流体萃取法、微波辅助法、超声波辅助法等。其中，有机溶剂浸提法是操作最为简便的方法，但却存在着提取效率较低的缺陷。发明内容 0005 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高效提取牡丹原。

9、花色素的方法，以解决现有技术中牡丹原花色素提取效率较低的问题。 0006 为解决上述技术问题，本发明所述的一种高效提取牡丹原花色素的方法，包括如下步骤： 0007 (1)取新鲜牡丹花瓣洗净并晾干，随后将处理后的牡丹花瓣进行自然堆积，并均匀喷洒含有复合酶制剂的复合酶液进行堆渥处理，得到预处理后的牡丹花瓣； 0008 (2)直接取预处理后的牡丹花瓣进行有机溶剂浸渍提取，过滤得到粗滤液； 0009 (3)将所得粗滤液进行抽滤并浓缩，得到所需牡丹原花色素提取物。说明书 1/7 页 3 CN 110845465 A 3 0010 所述步骤(1)中，所述复合酶制剂包括纤维素酶和葡萄。

10、糖氧化酶。 0011 所述步骤(1)中，所述纤维素酶和葡萄糖氧化酶的质量比为1-3： 1。 0012 所述步骤(1)中，所述复合酶制剂的用量占所述牡丹花瓣质量的6-10wt。 0013 所述步骤(1)中，所述复合酶液的质量浓度为2-5wt。 0014 所述步骤(1)中，所述堆渥步骤中，堆渥温度为28-35，堆渥时间为10-12h。 0015 所述步骤(2)中，所述有机溶剂浸提步骤包括按照1： 3-5的料液比加入无水乙醇，于常温下进行浸渍提取2-4h的步骤。 0016 本发明还公开了由所述高效提取牡丹原花色素的方法制备得到的牡丹原花色素，所述牡丹原花色素可用于清除二苯代苦味酰基。

11、自由基、超氧阴离子自由基和羟基自由基。 0017 本发明还公开了所述牡丹原花色素用于制备抗氧化剂的用途。 0018 本发明所述高效提取牡丹原花色素的方法，通过采用喷洒复合酶制剂并进行堆渥的方式，对牡丹花瓣进行有效的预处理，有助于加速色素成分的转移和扩散，从而提高后续牡丹原花色素再有机溶剂中的浸出效率，以达到原花色素的高效提取。相比于直接进行酶液提取的方式，本发明方法具有更高的原花色素提取效率。 0019 本发明通过体外实验运用分光光度计法分别进行了牡丹原花色素对DPPH、 OH、 O2-的清除及总抗氧化能力的测定，证明其在抗氧化方面的效用，为牡丹原花色素的综合利用和。

12、深度开发提供科学的参考和依据。具体实施方式 0020 本发明下述实施例中选用牡丹花为新鲜初乌牡丹花，由山东省菏泽新奇牡丹栽培基地提供。 0021 实施例1 0022 本实施例所述高效提取牡丹原花色素的方法，具体包括如下步骤： 0023 (1)将采摘下来的新鲜牡丹花花瓣洗净并晾干，取1kg处理后的牡丹花瓣进行自然堆积；另取纤维素酶30g、葡萄糖氧化酶30g混合并溶于水制成质量浓度2wt的复合酶液；将所得复合酶液均匀喷洒于所述牡丹花瓣中，并在喷洒过程中均匀翻动，确保酶液均匀喷洒；将喷洒后的牡丹花瓣于30进行自然堆渥12h，得到预处理后的牡丹花瓣，备用； 0024 (2。

13、)直接取上述预处理后的牡丹花瓣，按照1： 3的料液比加入无水乙醇溶液混匀，于常温下进行浸渍提取3h，过滤得到粗滤液； 0025 (3)将所得粗滤液进行抽滤得到原花色素提取液，随后用旋转蒸发器蒸馏法进行浓缩，得到所需牡丹原花色素提取物。 0026 实施例2 0027 本实施例所述高效提取牡丹原花色素的方法，具体包括如下步骤： 0028 (1)将采摘下来的新鲜牡丹花花瓣洗净并晾干，取1kg处理后的牡丹花瓣进行自然堆积；另取纤维素酶60g、葡萄糖氧化酶20g混合并溶于水制成质量浓度5wt的复合酶液；将所得复合酶液均匀喷洒于所述牡丹花瓣中，并在喷洒过程中均匀翻动，确保酶液均。

14、匀喷洒；将喷洒后的牡丹花瓣于30进行自然堆渥12h，得到预处理后的牡丹花瓣，备用； 0029 (2)直接取上述预处理后的牡丹花瓣，按照1： 5的料液比加入无水乙醇混匀，于常温下进行浸渍提取3h，过滤得到粗滤液；说明书 2/7 页 4 CN 110845465 A 4 0030 (3)将所得粗滤液进行抽滤得到原花色素提取液，随后用旋转蒸发器蒸馏法进行浓缩，得到所需牡丹原花色素提取物。 0031 实施例3 0032 本实施例所述高效提取牡丹原花色素的方法，具体包括如下步骤： 0033 (1)将采摘下来的新鲜牡丹花花瓣洗净并晾干，取1kg处理后的牡丹花瓣进行自然堆积；。

15、另取纤维素酶60g、葡萄糖氧化酶30g混合并溶于水制成质量浓度3wt的复合酶液；将所得复合酶液均匀喷洒于所述牡丹花瓣中，并在喷洒过程中均匀翻动，确保酶液均匀喷洒；将喷洒后的牡丹花瓣于30进行自然堆渥12h，得到预处理后的牡丹花瓣，备用； 0034 (2)直接取上述预处理后的牡丹花瓣，按照1： 4的料液比加入无水乙醇溶液混匀，于常温下进行浸渍提取3h，过滤得到粗滤液； 0035 (3)将所得粗滤液进行抽滤得到原花色素提取液，随后用旋转蒸发器蒸馏法进行浓缩，得到所需牡丹原花色素提取物。 0036 实施例4 0037 本实施例所述高效提取牡丹原花色素的方法，具体包括如下。

16、步骤： 0038 (1)将采摘下来的新鲜牡丹花花瓣洗净并晾干，取1kg处理后的牡丹花瓣进行自然堆积；另取纤维素酶40g、葡萄糖氧化酶40g混合并溶于水制成质量浓度4wt的复合酶液；将所得复合酶液均匀喷洒于所述牡丹花瓣中，并在喷洒过程中均匀翻动，确保酶液均匀喷洒；将喷洒后的牡丹花瓣于30进行自然堆渥12h，得到预处理后的牡丹花瓣，备用； 0039 (2)直接取上述预处理后的牡丹花瓣，按照1： 4的料液比加入无水乙醇溶液混匀，于常温下进行浸渍提取3h，过滤得到粗滤液； 0040 (3)将所得粗滤液进行抽滤得到原花色素提取液，随后用旋转蒸发器蒸馏法进行浓缩，得到所需。

17、牡丹原花色素提取物。 0041 对比例1 0042 本对比例所述提取原花色素的方法同实施例3，其区别仅在于，不进行步骤(1)中牡丹花瓣的预处理。 0043 对比例2 0044 本对比例所述提取原花色素的方法同实施例3，其区别仅在于，不进行步骤(1)中牡丹花瓣的预处理，并在所述步骤(2)的有机溶剂浸渍提取步骤中加入相同量的复合酶。 0045 对比例3 0046 本对比例所述提取原花色素的方法同实施例3，其区别仅在于，不进行步骤(1)中牡丹花瓣的预处理，并在所述步骤(2)的有机溶剂浸渍提取步骤中加入与所述复合酶相同量的纤维素酶。 0047 对比例4 0048 本对比例所述提。

18、取原花色素的方法同实施例3，其区别仅在于，不进行步骤(1)中牡丹花瓣的预处理，并在所述步骤(2)的有机溶剂浸渍提取步骤中加入与所述复合酶相同量的葡萄糖氧化酶。 0049 对比例5 0050 本对比例所述提取原花色素的方法同实施例3，其区别仅在于，不进行步骤(1)中牡丹花瓣的预处理，并在所述步骤(2)的浸渍提取步骤中采用与乙醇相同量的复合酶液进说明书 3/7 页 5 CN 110845465 A 5 行提取。 0051 分别称取上述实施例1-4和对比例1-5中提取得到的含牡丹原花色素的浸膏量，并测量浸膏中牡丹原花色素的含量，计算得到提取的原花色素量，记录结果于下表1。。

19、 0052 表1牡丹原花色素含量结果 0053 编号原花色素量/g 实施例123.557 实施例222.876 实施例325.796 实施例424.974 对比例110.223 对比例215.015 对比例314.608 对比例410.421 对比例55.192 0054 可见，本发明所述预处理方法可有效提高牡丹原花色素的提取效率。 0055 实验例 0056 本发明下述实验例中涉及试剂包括： 0057 (1)FRAP工作液： 0058 40mmol/L盐酸溶液：取浓盐酸0.1mL加水至30mL，置于避光处； 0059 20mmol/L三氯化铁溶液：称取0.1625g的FeCl3，用。

20、蒸馏水定容至50mL，置于避光处，备用； 0060 0.3mol/L醋酸钠缓冲溶液：称取醋酸钠5.1g，加冰醋酸20mL，用水稀释定容至 250mL，置于避光处备用； 0061 10mmol/L的TPTZ溶液：称取TPTZ样品31.233mg，用40mmol/L的盐酸定容至10mL，置于冰箱备用； 0062 将醋酸钠缓冲液、三氯化铁溶液、 TPTZ溶液按照10:1:1混合成36mL的FRAP工作液； 0063 (2)0.2mmol/L DPPH溶液：称取DPPH 0.0078g，溶于无水乙醇，定容至100mL； 0064 (3)0.01mol/L PBS：称取N。

21、aCl 8.5g， KCl 0.2g， Na2HPO412H2O 2.85g， KH2PO4 0.27g，溶于蒸馏水，定容至100mL； 0065 (4)9mmol/L FeSO4溶液：称取FeSO4 0.2502g溶于去离子水，定容至100mL； 0066 (5)9mmol/L H2O2溶液：称取H2O2 0.0306g溶于去离子水，定容至100mL； 0067 (6)9mmol/L水杨酸溶液：称取水杨酸0.1243g溶于无水乙醇，定容至100mL； 0068 (7)50mmol/L PH8.2 Tris-HCI缓冲液(25)： 0069 甲液： 0.1mol/LTris溶液。

22、：称取1.2114gTris溶于去离子水，定容至100mL； 0070 乙液： 0.1mol/LHCI溶液：称取0.3646gHCI溶于去离子水，定容至100mL； 0071 取50mL甲液、 22.9mL乙液混匀，定容至100mL，即为50mmol/L PH8.2Tris-HCI缓冲液(25)； 0072 (8)50mmol/L邻苯三酚溶液：称取0.6306g邻苯三酚溶于去离子水，定容至100mL。说明书 4/7 页 6 CN 110845465 A 6 0073 1、牡丹原花色素总抗氧化能力的测定 0074 FRAP(亚铁还原能力)工作液呈茶色，当遇到FeSO4时会。

23、发生一系列的化学变化。使其呈现蓝色，根据加入的FeSO4的浓度的不同，会呈现一系列梯度的蓝色，且颜色深浅程度与FeSO4呈线性关系进而绘出标准曲线，样品的总抗氧化能力就通过FeSO4的数量关系表现出来。 0075 制作FeSO4标准曲线：称取0.0278g的FeSO4溶于双蒸水定容至100mL，为(浓度数值) FeSO4母液，取8支试管编号，按表2配制标准溶液。 0076 表2不同浓度FeSO4溶液配制表 0077 0078 取8支试管分别加入4mL的FRAP工作液和0.6mL的各浓度FeSO4混匀， 37水浴加热 10min，紫外可见分光光度计比色测定，绘制标准曲。

24、线。 0079 FeSO4标准曲线方程为y2.4486x+0.01071， R20.99493。 0080 牡丹原花色素总抗氧化能力测定结果如表3，由表3可知，其总抗氧化能力随着色素溶液浓度的增大而增强。 0081 表3牡丹原花色素总抗氧化能力 0082 色素溶液浓度(mL/mL)定量测定浓度(mmol/L)OD593nm 0.10.14500.365 0.50.18800.469 10.21300.530 50.23000.572 100.24900.616 500.34500.848 0083 2、对DPPH清除能力的测定 0084 DPPH(二苯代苦味酰基自由基)的乙醇溶液呈紫色。

25、，其自由基有单个电子，在517nm 处有特征吸收峰，当有自由基去除剂存在时，由于单电子配对从而使高吸收峰逐渐消失，醇溶液也开始褪色，且褪色程度与接受配对的电子数量呈线性关系，因而可用分光光度法进行定量分析。 0085 分别配制浓度梯度为0.001mg/mL、 0.01mg/mL、 0.05mg/mL、 0.1mg/mL、 0.5mg/mL、 1mg/mL、 5mg/mL、 10mg/mL的牡丹原花色素溶液，按要求加入各色素溶液2mL、 DPPH 2mL、 PBS 100 L，避光反应20min， 532nm下测各样品的光吸收值。 0086 牡丹原花色素对DPPH清除率结果。

26、： 0087 DPPH自由基的清除率()1-(As-Ab)/Ac100；说明书 5/7 页 7 CN 110845465 A 7 0088 其中， As为牡丹原花色素溶液样品与DPPH混合后的光密度值； Ab为样品液不加 DPPH的光密度值； Ac为不加样品液的DPPH溶液的空白光密度值。 0089 牡丹原花色素对DPPH自由基的清除率如下表4所示，由表4可以看出其对DPPH 具有很高的清除能力，清除率高达87.08，且清除能力随着色素溶液浓度的增大而增强。 0090 表4牡丹原花色素溶液的DPPH自由基清除率 0091 色素溶液浓度(mg/mL)AsAbAc清除率() 0.0011.。

27、0180.0001.0371.83 0.010.9560.0011.0377.91 0.050.8420.0091.03719.67 0.10.8020.0251.03725.07 0.50.7840.0591.03730.09 10.7690.1161.03737.03 51.0180.6341.03762.97 101.4821.3481.03787.08 0092 3、对OH清除能力的测定： 0093 利用H2O2与Fe2+混合产生OH，OH易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可在体系中加入水杨酸捕捉体系中的OH并产生有色物质，该物质在510nm下有最大吸收峰。当有自由基去除。

28、剂存在时，生成的OH就会减少，从而使有色化合物的量相应减少。采用固定反应时间法，在510nm处测量含被测物反应液的吸光度，并与空白液比较，以测定被测物对羟自由基的清除作用。 0094 在10mL试管中依次加入9mmol/LFeSO4溶液2mL；浓度分别为0.001mg/mL、 0.01mg/ mL、 0.05mg/mL、 0.1mg/mL、 0.5mg/mL、 1mg/mL、 5mg/mL、 10mg/mL的牡丹原花色素溶液2mL； 9mmol/LH2O22mL，摇匀，静置10min，再加入9mmol/L的水杨酸2mL，摇匀， 37反应30min，以去离子水作为参。

29、比，在510nm下测量各样品的光密度值。 0095 牡丹原花色素对OH清除率结果： 0096OH自由基的清除率()1-(A-A1)/A0100； 0097 其中， A为加入样品和显色剂H2O2的光密度值； A1为样品液不加显色剂H2O2色素溶液的光密度值； A0为不加样品液的空白对照的光密度值。 0098 测定结果如表5所示，由表5可以看出，牡丹原花色素对OH的清除能力非常强，清除率高达80.05，且清除能力随着色素溶液浓度的增大而增强。 0099 表5牡丹原花色素溶液的OH自由基清除率 0100 色素溶液浓度(mg/mL)AA1A0清除率() 0.0012.3400.0632.。

30、3111.47 0.012.3390.0892.3112.64 0.052.2610.1022.3116.58 0.12.1090.1322.31114.45 0.51.2810.3352.31159.06 11.0630.6022.31180.05 0101 4、对O2-清除能力的测定说明书 6/7 页 8 CN 110845465 A 8 0102 O2-(超氧阴离子自由基)难于用一般方法产生和检测，但是在弱碱性条件下，邻苯三酚能发生自氧化反应，生成O2-和有色中间物质，该中间物质在327nm处有一特征吸收峰。在初始阶段，中间产物的量与时间成线性关系。当加入O2-清除。

31、剂时，其能迅速与O2-反应，从而阻止中间产物的积累，致使溶液在327nm处吸收减弱。故可以通过测定OD327nm来评价清除剂对O2-的清除作用。 0103 在反应体系中依次加入PH8.2 50mmol/LTris-HCI缓冲液3.8mL，各浓度原花色素样品溶液2mL， 25保温10min，再加入25预热的50mmol/L邻苯三酚溶液0.2mL，将混合物于25下反应20min，在327nm下测定光密度值A3；将邻苯三酚溶液用等体积25预热的 0.1mol/LHCl溶液代替，其他操作相同，测定光密度值A2；将样品溶液用等体积的蒸馏水代替，其他操作相同，测定光密。

32、度值A1。 0104 牡丹原花色素对O2-清除率结果： 0105 O2-自由基的清除率()1-(A3-A2)/A1100； 0106 其中， A1为不加入样品的空白对照的光密度值； A3为加入样品液和邻苯三酚的色素溶液的光密度值； A2为不加邻苯三酚的色素溶液的光密度值。 0107 测定结果如如表6所示，由表6可以看出，牡丹原花色素对O2-的清除能力非常强，清除率高达99.96，且清除能力随着色素溶液浓度的增大而增强。 0108 表6牡丹原花色素溶液的O2-自由基清除率 0109 色素溶液浓度(mg/mL)A3A2A1清除率() 0.0011.9570.0331.9541.54 0.011.9560.091.9544.50 0.051.9540.2191.95411.21 0.11.9530.4171.95421.39 0.51.9521.6371.95483.88 11.951.9441.95499.96 0110 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。说明书 7/7 页 9 CN 110845465 A 9 。