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欧美杨组织培养获得再生植株的方法.pdf

花匠小妙招
2024-11-23 23:04

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1、(10)授权公告号 CN 101715731 B (45)授权公告日 2012.05.09 CN 101715731 B *CN101715731B* (21)申请号 200910311186.1 (22)申请日 2009.12.10 A01H 4/00(2006.01) (73)专利权人河南科技大学地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人周洲李永丽陈迪新陈双臣刘爱荣王少先 (74)专利代理机构郑州睿信知识产权代理有限公司 41119 代理人陈浩 (54) 发明名称欧美杨组织培养获得再生植株的方法 (57) 摘要本发明涉及一种欧美杨组织培。

2、养获得再生植株的方法，包括无菌外植体的获得，愈伤组织的诱导分化，抽茎及壮苗，生根培养。本发明方法便于操作和控制，周年可重复生产，能有效满足目前对杨树研究和栽培的需要；且本发明方法中不定芽的诱导率最高达 100，生根率达 96.7以上，很大程度上提高了组织培养获得再生植株的效率。 (51)Int.Cl. 审查员苏聃 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 1 页说明书 3 页附图 1 页 CN 101715731 B1/1 页 2 1. 欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤无菌外植体的获得：。

3、以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄清洗消毒获得无菌叶柄外植体；愈伤组织的诱导分化：将无菌叶柄接种于诱导培养基上，两周后开始分化出大量不定芽， 14-20 天继代培养一次；抽茎及壮苗：将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基上，抽茎培养至丛生芽高于 2cm 后，将丛生苗转移至壮苗培养基上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗；生根培养：将无根苗单株接种到生根培养基中，培养获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗；所述的诱导培养基为 MS+TDZ 0.025-0.1mg/L+6-BA 0.025-0.1mg/L+NAA 0.02-0.1mg/ L+ 蔗糖 20-40g/L ；。

4、抽茎培养基为 MS+KT 0.5-1mg/L+GA3 1-4mg/L+ 果糖 20-40g/L ；壮苗培养基不含植物激素的 MS+ 蔗糖 20-40g/L ；生根培养基： 1/2MS+IBA 0.02-0.1mg/L+IAA 0.02-0.1mg/L+ 活性炭 1-5mg/L+ 蔗糖 20-40g/L。 2. 根据权利要求 1 所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于：所述培养基均含 4-6g/L 的琼脂， pH 值为 5.6-6.2。 3. 根据权利要求 1 所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于：所述的组织培养的培养温度应控制在24-26，。

5、光照强度为1500-2000lx，光照时间为12-16小时。 4. 根据权利要求 1 所述的欧美杨组织培养获得再生植株的方法，其特征在于：所述的叶柄清洗消毒的方法包括叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用 70%-75% 乙醇处理 30-50s，无菌水冲洗除去残留物；再用 0.5-1g/L 氯化汞溶液消毒 3-6min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体。权利要求书 CN 101715731 B1/3 页 3 欧美杨组织培养获得再生植株的方法技术领域 0001 本发明涉及一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法，属于植物组织培养技术领域。

6、。背景技术 0002 我国的杨树基因工程已经取得了许多成果，但转基因受体杨树多不是主栽品种，已有转基因杨树其速生性和适应性都受到先天条件的局限，许多基因工程研究成果未能在林业生产中广泛应用 ( 参见卢孟柱胡建军于 2006 年在林业科技开发上发表的我国转基因杨树的研究及应用现状)。为了使杨树基因工程改良研究与林业生产实际应用更紧密结合，从生产中一些重要的主栽品种的遗传转化进行突破具有重大现实意义，目前世界上人工栽培的杨属品种有90以上都源于黑杨派即欧美杨。欧美杨2001适应性强，在耐寒、耐旱、抗病虫等方面都具有优越性，适宜在中国西部及华北地区广泛种植；欧美杨。

7、 2001 是一种理想的转基因受体材料，因此外植体的高效的组培再生体系成功建立，对其生物学研究、遗传改良和遗传转化研究工作奠定了基础。发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法。 0004 本发明的技术方案在于采用一种欧美杨组织培养获得再生植株的方法，该方法包括以下步骤： 0005 无菌外植体的获得：以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄清洗消毒获得无菌叶柄外植体； 0006 愈伤组织的诱导分化：将无菌叶柄接种于诱导培养基上，两周后开始分化出大量不定芽， 14-20 天继代培养一次； 0007 抽茎及壮苗：将丛生芽连同外植体转。

8、接到抽茎培养基上，抽茎培养至丛生芽高于 2cm 后，将丛生苗转移至壮苗培养基上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗； 0008 生根培养：将无根苗单株接种到生根培养基中，培养获得主根粗壮，侧根丰富的幼苗。 0009 所述的诱导培养基为 MS+TDZ0.025-0.1mg/L+6-BA0.025-0.1mg/ L+NAA0.02-0.1mg/L+ 蔗糖 20-40g/L。 0010 所述的抽茎培养基为 MS+KT0.5-1mg/L+GA3 1-4mg/L+ 果糖 20-40g/L。 0011 所述的壮苗培养基不含植物激素的 MS+ 蔗糖 20-40g/L。 0012 所述的生根培。

9、养基： 1/2MS+IBA0.02-0.1mg/L+IAA0.02-0.1mg/L+ 活性炭 1-5mg/ L+ 蔗糖 20-40g/L。 0013 所有培养基均含 4-6g/L 的琼脂， pH 值为 5.6-6.2。 0014 所述的组织培养的培养温度应控制在 24-26，光照强度为 1500-2000lx，光照时间为 12-16 小时。说明书 CN 101715731 B2/3 页 4 0015 所述的叶柄清洗消毒的方法包括叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用 70 -75乙醇处理 30-50s，无菌水冲洗除去残留物；再用 0.5-1g/L 氯化汞溶液消毒。

10、 3-6 分钟，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体。 0016 本发明所使用的欧美杨为欧美杨 2001。 0017 本发明方法的优势在于：培养过程便于操作和控制，周年可重复生产，能有效满足全年对杨树组培苗的要求；且本发明方法中不定芽的诱导率最高可达 100，生根率达 96.7以上，提高了通过组织培养获得再生植株的效率。附图说明 0018 图 1 为本发明方法获得的再生植株各阶段生长情况示意图， a 为丛生芽， b 为抽茎的丛生芽， c 为壮苗后的丛生芽， d 为生根后的幼苗。具体实施方式 0019 实施例 1 0020 本实施例欧美杨组织培养获得再生植株。

11、的方法包括以下步骤 0021 无菌外植体的获得：以欧美杨 2001 一年生枝条扦插苗上新生健康嫩枝为材料，将叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用 70乙醇处理 30s，无菌水冲洗除去残留物；再用 1g/L 氯化汞溶液消毒 5min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体； 0022 愈伤组织的诱导分化：将无菌叶柄接种于诱导培养基 (MS+TDZ0.05mg/ L+6-BA0.05mg/L+NAA0.05mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 5g/L， pH 值为 5.8) 上， 5d 后切口部变红膨大，开始形成绿色愈伤组织， 14d 后愈伤组织。

12、上开始出现大量的不定芽，芽丛生无茎 ( 图 1-a)，每隔 15d 在诱导培养基上继代一次，共接种 120 个无菌叶柄段，所有叶柄均能诱导分化出丛生芽，不定芽诱导率达 100 ； 0023 抽茎及壮苗：丛生芽连同原外植体转接到抽茎培养基 (MS+KT0.5mg/L+GA32mg/ L+ 果糖 20g/L+ 琼脂 5g/L， pH 值为 5.8) 上，抽茎培养，丛生芽细弱 ( 图 1-b) ；待丛生芽高于 2cm 后，将丛生苗转移至壮苗培养基 (MS+ 蔗糖 200g/L+ 琼脂 5g/L， pH 值为 5.8) 上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗 ( 图 1-c) 。

13、； 0024 生根培养：选择 4 6cm 高、叶色正常、茎干粗壮的无根苗接种到生根培养基 (1/2MS+IBA0.1mg/L+IAA 0.02mg/L+ 活性炭 2mg/L+ 蔗糖 200g/L+ 琼脂 5g/L， pH 值为 5.8) 上，接种7d后幼苗基部出现红色粗壮根点， 20d后根长达4cm左右，主根粗壮，侧根数量丰富 ( 图 1-d)，共接种 50 棵无根苗，其中 49 棵生根，生根率达 98。 0025 其中组织培养的培养温度应控制在 25，光照强度为 2000lx，光照时间为 15 小时。 0026 实施例 2 0027 本实施例欧美杨组织培养获得再生植。

14、株的方法包括以下步骤 0028 无菌外植体的获得：以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用70乙醇处理30s，无菌水冲洗除去残留物；再用0.5g/L氯化汞溶液消毒 6min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体；说明书 CN 101715731 B3/3 页 5 0029 愈伤组织的诱导分化：将无菌叶柄接种于诱导培养基 (MS+TDZ0.025mg/ L+6-BA0.1mg/L+NAA 0.02mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L， pH 值为 5.6) 上，两周后开始分化出大量不定芽， 14 天继代培养。

15、一次，共接种 120 个无菌叶柄段，其中 109 个叶柄能诱导分化出丛生芽，不定芽诱导率达 91 ； 0030 抽茎及壮苗：将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基 (MS+KT1mg/L+GA3 1mg/L+ 果糖 20g/L+ 琼脂 6g/L， pH 值为 5.6) 上，抽茎培养至丛生芽高于 2cm 后，将丛生苗转移至壮苗培养基 (MS+ 蔗糖 40g/L+ 琼脂 4g/L， pH 值为 5.6) 上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗； 0031 生根培养：选择 4 6cm 高、叶色正常、茎干粗壮的无根苗接种到生根培养基 (1/2MS+IBA 0.02mg/L+IA。

16、A0.1mg/L+ 活性炭 1mg/L+ 蔗糖 40g/L+ 琼脂 4g/L， pH 值为 5.6) 中，接种7d后幼苗基部出现红色粗壮根点， 20d后根长达4cm左右，主根粗壮，侧根丰富的幼苗，共接种 60 棵无根苗，其中 58 棵生根，生根率达 96.7。 0032 其中组织培养的培养温度应控制在 24，光照强度为 1500lx，光照时间为 16 小时。 0033 实施例 3 0034 本实施例欧美杨组织培养获得再生植株的方法包括以下步骤 0035 无菌外植体的获得：以欧美杨健康嫩枝为材料，将叶柄于流动的自来水下冲洗后，置于超净工作台中用75乙醇处理50s，。

17、无菌水冲洗除去残留物；再用1g/L氯化汞溶液消毒 3min，最后用无菌水冲洗除去残留物，获得无菌叶柄外植体； 0036 愈伤组织的诱导分化：将无菌叶柄接种于诱导培养基 (MS+TDZ0.1mg/ L+6-BA0.025mg/L+NAA 0.1mg/L+ 蔗糖 40g/L+ 琼脂 4g/L， pH 值为 6.2) 上，两周后开始分化出大量不定芽， 20 天继代培养一次，共接种 120 个无菌叶柄段，其中 112 个叶柄能诱导分化出丛生芽，不定芽诱导率达 93 ； 0037 抽茎及壮苗：将丛生芽连同外植体转接到抽茎培养基 (MS+KT0.5mg/L+GA3 4mg/。

18、 L+ 果糖 40g/L+ 琼脂 4g/L， pH 值为 6.2) 上，抽茎培养至丛生芽高于 2cm 后，将丛生苗转移至壮苗培养基 (MS+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L， pH 值为 6.2) 上，使丛生苗生长为茎干健壮的无根苗； 0038 生根培养：选择 4 6cm 高、叶色正常、茎干粗壮的无根苗接种到生根培养基 (1/2MS+IBA0.1mg/L+IAA 0.02mg/L+ 活性炭 5mg/L+ 蔗糖 20g/L+ 琼脂 6g/L， pH 值为 6.2) 中，接种7d后幼苗基部出现红色粗壮根点， 20d后根长达4cm左右，主根粗壮，侧根丰富的幼苗，共接种 40 棵无根苗，其中 39 棵生根；生根率达 97.5。 0039 其中组织培养的培养温度应控制在 26，光照强度为 2000lx，光照时间为 12 小时。说明书 CN 101715731 B1/1 页 6 图 1 说明书附图。