甜菜花叶病毒RT
甜菜花叶病毒RT-PCR试剂盒
产品及特点：
1. 一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。
2. 根据甜菜花叶病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。
3. 灵敏度可以达到 1000 拷贝/反应。
4. 使用一管式 RT-PCR 技术，RT 和 PCR 两步在一个试管内完成，不需要中间转移样品，降低了操作误差和可能的污染。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的 RT-PCR。
6. 本产品只能用于科研，不能用于临床。
规格及成分：
编号
成分
规格
试剂一
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer
200 μL（橘黄盖）
试剂二
MMLV-Taq Mix
75 μL（红盖）
试剂三
超纯水
1 mL（亮黄盖）
试剂四
甜菜花叶病毒 RT-PCR 引物混合液
100 μL（白盖）
试剂五
甜菜花叶病毒 RT-PCR 阳性对照（1×10E8/μL）
50 μL（黄盖）
试剂六
使用手册
1 份
注：为避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA 片段作为阳性对照。
运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。
自备试剂：
样品 RNA。
使用方法：
一、样品 DNA 的制备：
1. 如果有 N 个样品，必须设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用 10μL 甜菜花叶病毒 PCR阳性对照的 1000 倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。
2. 用自选方法纯化 N+2 个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。
二、设置RT-PCR反应(20 μL 体系)：
3. 如果有 N+2 个样品，则标记 N+4 个 PCR 管（额外增加的两个管一个是RT-PCR 阳性对照，另一个是 RT-PCR 阴性对照）并按照下表在 PCR 管中加入下列成分：
成份
N+2 个
样品管
RT-PCR
阴性对照
RT-PCR
阳性对照
5×双酶一管式RT-PCR Buffer
各 4 μL
4 μL
4 μL
甜菜花叶病毒 RT-PCR 引物混合液
各 2 μL
2μL
2μL
N+2 个制备的 RNA 样品
各 12.5μL
--
--
超纯水
--
12.5μL
--
甜菜花叶病毒 RT-PCR 阳性对照的 1000倍稀释液
--
--
12.5μL
MMLV-Taq Mix
1.5 μL
1.5 μL
1.5 μL
4.上机进行 RT-PCR，RT-PCR 反应参数为:
过程
温度
时间
逆转录
42℃
30 min
预变性
95℃
5 min
PCR反应35个循环
95℃
30 sec
58℃
30 sec
72℃
20 sec
延伸
72℃
7 min
三、电泳检测：
5. 琼脂糖电泳检测扩增效果。如果阴性对照有扩增产物或阳性对照无扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有扩增产物、阳性对照必须有预期条带出现，才有必要分析样品的实验结果，如果有预期片段大小的扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。
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