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向日葵S 2腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与分析

花匠小妙招
2024-11-25 20:38

向日葵S2腺苷甲硫氨酸合成酶基因克隆与分析周向红王萍(淮海工学院海洋学院,222005,江苏连云港)摘要为了研究S2腺苷甲硫氨酸合成酶(S2adenosylmethioninesynthetase,SAMS)在向日葵(He2lianthusannuus)抗旱和耐盐过程中的作用,先根据计算机辅助克隆结果设计引物,抽提盐胁迫向日葵叶片的总RNA,然后采用RT2PCR扩增技术克隆了向日葵的1个SAMS基因(命名为HaSAMS1),HaSAMS1基因的编码序列长1173bp,编码390个氨基酸残基。HaSAMS1没有跨膜结构域,没有信号肽,含有SAMS蛋白的特征序列。HaSAMS1与其他物种的SAMS具有较高的序列相似性,与茼蒿(Chrysanthemumcoronarium)和拟南芥(Arabidopsisthaliana)等高等植物SAMS的氨基酸序列一致性介于8618%~9619%。HaSAMS1基因的克隆为进一步研究向日葵抗旱和耐盐机理奠定了基础。关键词向日葵;S2腺苷甲硫氨酸合成酶;SAMS基因;克隆S2腺苷甲硫氨酸合成酶(S2adenosylmethioninesynthetase,SAMS,EC:2151116)在生物体内催化三磷酸腺苷和L2甲硫氨酸反应生成S2腺苷甲硫氨酸(S2adenosylmethionine,SAM)[1]。SAM是生物体内重要的中间代谢物,参与转甲基、转硫、转氨丙基等反应[1]。SAM作为前体或供体能合成乙烯(ethyl2ene)、多胺(polyamine)和甜菜碱(betaine),这些物质在植物体内参与了逆境的抵抗过程[2],因此SAMS在抗旱和耐盐过程中发挥积极作用。来自基因表达分析的数据表明了SAMS基因受干旱和盐胁迫的诱导表达[3-4]。不仅如此,超表达SAMS还能提高转基因植物的抗旱和耐盐能力[5]。向日葵(Helianthusannuus)是一种重要的油料作物,在世界各地广泛栽培。它具有较强的抗旱性

作者简介:周向红,实验师,主要从事生物化学与分子生物学教学与研究王萍为通讯作者,教授,主要从事植物基因工程研究基金项目:教育部大豆重点实验室开放课题(SB08A03);淮海工学院自然科学研究项目(2010150023)收稿日期:2011-08-10和耐盐性,能生长于较干旱地区和盐碱地区。这种特性引起了各国学者的关注,已从形态学和生理学等多方面探讨了向日葵的抗旱和耐盐机理[6]。但是目前尚无向日葵SAMS基因克隆的报道,而且SAMS在向日葵的抗旱和耐盐过程中发挥何种作用及其作用程度也不清楚。因此,本试验采用计算机辅助克隆技术快速获得了向日葵的1个SAMS基因(命名为HaSAMS1),并分析了其序列特征,为进一步研究HaSAMS1在抗旱和耐盐过程中的作用机理乃至开展遗传改良工作奠定了基础。1材料与方法111试验材料依据王萍等[7]的研究结果,选用耐盐性好的向日葵品种长岭白作为试验材料,向日葵种子于室温下浸种24h后播种,待向日葵长至四叶期时用018%的NaCl浇灌,盐胁迫2d后剪取幼嫩叶片用于总RNA抽提。112总RNA的分离纯化参照周向红等[8]的CTAB改良法提取总RNA。取100mg叶片,液氮研磨,加入700LLCTAB裂解液进行裂解,接着加氯仿抽提,用LiCl选择性沉淀总RNA,75%乙醇漂洗沉淀,最后用无RNase水溶解RNA沉淀。总RNA的完整性和纯度通过琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪(Bio2Rad)检测。113计算机辅助克隆与引物设计计算机辅助克隆技术路线参照易乐飞等[9]的方法,利用向日葵EST(expressedsequencetag)序列拼接得到了HaSAMS1基因的核酸序列。接着对此序列进行编码区(codingregion)预测,然后在编码区两外侧设计1对引物,上游引物:5cCTTCCCATCCT2TCCCACG3c,下游引物:5cGAAAACAACATGC2CGAGTGA3c,预期的扩增产物长1288bp,且包含HaSAMS1基因的完整编码区。114RT2PCR反应取1Lg总RNA,以Oligo(dT)为引物,按Rever210作物杂志2011Crops16